龙胆苦苷对肝细胞表面膜转运蛋白MRP3、MRP4的表达影响

研究背景及目的 胆汁淤积是由于多种原因所导致的胆汁流动异常而引起的常见临床综合症，直接导致肝细胞损伤、肝功能衰竭。其共同的分子发生机制为：肝细胞表面胆汁酸转运蛋的表达异常。在生理状态下，机体内胆汁酸处于稳定状态，而分布于“极性化”肝细胞膜上的胆酸转运蛋白系统的精密调节是维持这种稳态的关键，它们主要包括：肝细胞顶膜的MRP2(multidrug resistance-associated protein2)、BSEP (Bile salt export pump)等；基底侧膜的MRP3(multidrug resistance-associated protein3)、MRP4(multidrugresistance-associated protein4)等。先天或后天获得性致病因素常导致肝细胞膜胆酸转运蛋白异常表达，致使胆酸排泌障碍，胆汁酸稳态失衡，发生、发展为胆汁淤积症。正常情况下，MRP3低表达或不表达，而在胆汁淤积情况下则高表达。因此，胆汁淤积情况下MRP3高表达被认为是肝脏自我保护性反应机制之一。MRP4与MRP3相似，它能够促使更多的胆汁酸排入血液。我们及国外同行前期在动物实验和人体标本研究发现，MRP3分子在胆汁淤积中对保护肝细胞起到了关键作用。在胆汁淤积的大鼠模型、梗阻性黄疸及Dubin综合征患者的肝脏组织标本中，均发现了MRP3蛋白的高表达。而MRP4基因敲除的大鼠胆汁淤积的模型中发现其肝损伤的程度明显严重于野生型大鼠胆汁淤积模型。 目前，胆汁淤积的临床治疗缺乏有效的药物，UDCA是唯一应用于临床且公认有一定疗效的药物，但其治疗效果有限、个体差异大、副作用大；利福平、苯巴比妥等药物的治疗效果不理想。川西獐芽菜是治疗“肝胆湿热症”功效独特的名贵药材。我们从中分离出了24种对治疗胆汁淤积可能有效单体，其中发现龙胆苦苷不仅可以刺激MRP3分子的高表达，同时还可能上调促进胆酸排泌的MRP2、MRP4、BSEP基因的表达。这在胆汁淤积状态下将更有利于胆汁酸、胆红素等有毒物质及时排泌出肝细胞，起到保护肝脏的作用，其治疗胆汁淤积的效果理论上也应该更优越于UDCA。因此，川西獐牙菜单体“龙胆苦苷”为解决“胆汁淤积的临床治疗缺乏特效药物”这一难题提供了新的重要线索。 研究方法 1.龙胆苦苷50μM体外刺激HepG2细胞，以UDCA50μM为阳性对照、DMSO50μM为阴性对照。Real Time PCR检测药物对HepG2细胞膜转运蛋白MRP3、MRP4及其相关核受体VDR、PXR、CAR、RXR及RAR基因mRNA表达的影响；Western Blot检测药物对HepG2细胞膜转运蛋白MRP3、MRP4及其相关核受体VDR、PXR、CAR、RXR及RAR蛋白表达的影响。 2.建立胆道结扎的大鼠胆汁淤积模型，随机分为实验组：龙胆苦苷100mg/kg、阳性对照组：UDCA90mg/kg、阴性对照组：生理盐水。处理7d后，HE染色观察肝脏损伤情况；Real Time PCR检测大鼠肝细胞膜转运蛋白Mrp3、Mrp4及其相关核受体VDR、PXR、CAR、RXR及RAR基因mRNA水平的变化；Western Blot检测大鼠肝细胞膜转运蛋白Mrp3、Mrp4及其相关核受体VDR、PXR、CAR、RXR及RAR蛋白水平的变化。 结果 1.细胞水平：Real Time PCR结果表明：龙胆苦苷不仅能够明显上调HepG2细胞表面膜转运蛋白MRP3、MRP4基因的表达也能够调节核受体CAR、PXR基因mRNA的表达；Western Blot结果表明：在蛋白水平，龙胆苦苷即能刺激HepG2细胞表面膜转运蛋白MRP3、MRP4的表达，又能够促进其相关核受体CAR及PXR的表达，这与mRNA水平变化一致，且龙胆苦苷的作用明显强于UDCA。 2.动物水平： Real Time PCR及Western Blot结果表明龙胆苦苷不仅在mRNA水平也能够在蛋白水平调节肝细胞膜转运蛋白Mrp3、Mrp4的表达且核受体CAR及PXR的表达也增高。 结论 本项研究的体内外实验均表明：龙胆苦苷能够刺激肝细胞表面膜转运蛋白MRP3、MRP4及其相关核受体CAR及PXR在mRNA和蛋白水平的表达，且其作用明显强于UDCA。因此，我们推测：龙胆苦苷通过核受体CAR及PXR调节肝细胞膜转运蛋白MRP3、MRP4的表达。