SUMO修饰对Tau蛋白磷酸化及其降解的影响

第一部分SUMO-1可诱导Tau蛋白过度磷酸化 阿尔兹海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种较为常见的、呈进行性发展的可致死性神经退行性疾病,其主要病理改变是以细胞内的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle, NFTs)和细胞外的老年斑(senile plaques, SPs)形成为特征。Tau蛋白是一种重要的微管相关蛋白,与微管一起构成神经细胞骨架结构,主要生理功能可促进微管蛋白聚合形成微管,维持其功能稳定。当Tau蛋白发生过度磷酸化时,将失去稳定微管的作用,并以其为中心导致NFTs的形成进而导致神经退行性病变。SUMO (small ubiquitin-like modifer)为小的泛素样修饰分子,含SUMO-1、SUMO-2、SUMO-3和SUMO-4四种类型,其功能是通过对底物蛋白进行SUMO修饰使底物蛋白的转录调控、底物蛋白功能和其在亚细胞器定位以及底物蛋白稳定性发生改变。底物蛋白的SUMO修饰可调节底物与其他蛋白之间的结合,即可干扰底物蛋白同其他蛋白的结合,又可为其他蛋白的结合提供位点,还可导致底物蛋白的空间构象发生改变从而暴露或隐藏了同其他蛋白的结合位点。SUMO与泛素可能存在相同的靶蛋白结合位点-赖氨酸残基,故有些靶蛋白SUMO化和其泛素化具有拮抗作用。现有研究已证明Tau能被SUMO-1修饰；导致Tau蛋白过度磷酸化的磷酸酯酶PP2A活性降低时可促进Tau的SUMO化；在AD转基因鼠中SUMO-1又能与磷酸化Tau共定位。由此提示Tau的磷酸化及其SUMO化二者之间具有某种特定的相关性。 目的：通过过表达SUMO-1然后检测Tau的过度磷酸化水平,检测Tau蛋白SUMO化修饰对其过度磷酸化的影响；通过上调GSK-3p活性和下调PP2A活性引起Tau的过度磷酸化,检测Tau的磷酸化对其SUMO化修饰的调节,阐明Tau蛋白SUMO化和其磷酸化的相互关系。 方法：在细胞水平,在稳定表达HEK293/Tau细胞中转染SUMO-1和在HEK293WT细胞中共同瞬时转染Tau+SUMO-1和共同瞬时转染突变TauK(340)R+SUMO-1使之过表达48小时,运用免疫印迹技术探讨SUMO-1过表达后Tau的磷酸化变化情况；在过表达SUMO-1基础上用PP2A抑制剂OA处理,观察Tau的磷酸化和其SUMO化变化；用SUMO特异性抑制剂Ginkgolic acid(GA)在细胞水平抑制SUMO-1再检测Tau蛋白磷酸化的变化情况。同时运用免疫荧光技术在细胞形态方面观察过表达SUMO-1时对Tau磷酸化的影响。在细胞和动物水平,上调GSK-3β活性后检测SUMO-1的表达水平变化情况及对Tau的SUMO化修饰影响。用免疫荧光技术观察人脑AD脑片中磷酸化Tau和SUMO-1的表达分布及共定位情况。 结果：在本实验中我们观察到如下结果：(1)无论是瞬时转染Tau还是稳定表达Tau,过表达SUMO-1都可增加Tau的磷酸化水平；而共转染突变质粒Tau K340R和SUMO-1后Tau的磷酸化水平则没有明显变化。抑制SUMO-1可下调Tau的磷酸化水平。(2)无论是激活GSK-3p活性或抑制PP2Ac活性引起的Tau蛋白磷酸化都可增加Tau的SUMO化。在细胞内,SUMO-1可增加Tau的磷酸化并与其共定位。首次在人AD患者脑片内发现聚积的磷酸化Tau和SUMO-1共定位。 结论：过表达SUMO-1可促进Tau的磷酸化；Tau的磷酸化也可增加其SUMO化。表明Tau的SUMO化与其磷酸化相互促进。第二部分SUMO-1通过抑制Tau的泛素化从而减缓Tau的降解,增加Tau的聚积 导致AD的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle, NFTs)的主要成分是异常过度磷酸化的Tau蛋白。Tau蛋白属于微管相关蛋白,其正常生理功能是促进微管蛋白聚合形成微管并维持微管的功能稳定。当Tau异常过度磷酸化时,将失去稳定微管的作用,并以其为中心导致NFTs的形成并进而参与多种神经退行性疾病的发生发展。异常蛋白的降解主要由两大降解系统完成,即泛素-蛋白酶体降解途径(Ubiquitin-proteasome system, UPS)、溶酶体-自噬系统(autophagy-lysosome pathway)途径及内质网相关降解通路(endoplasmic retieulum-associated degradation pathway)。大多数细胞内的异常蛋白或长寿命蛋白主要是通过UPS降解。过度磷酸化的Tau蛋白也可通过UPS降解,但在AD患者中NFTs虽然能被泛素修饰,但却不断沉积,其原因尚不清楚。SUMO-1为小泛素样修饰分子,其功能是通过对底物蛋白进行SUMO化修饰可改变底物蛋白质的稳定性、蛋白质功能、底物蛋白在亚细胞器定位及转录调控。SUMO-1与泛素可能存在相同的靶蛋白结合位点-赖氨酸残基,靶蛋白SUMO化和泛素化可能具有拮抗作用,同时,靶蛋白SUMO化还可导致其空间结构发生改变,从而影响其通过UPS进行降解。现有研究证实Tau蛋白既能被泛素修饰,又能被SUMO-1修饰,抑制蛋白酶小体时Tau的SUMO化降低；Tau的磷酸化还可增加Tau的SUMO化。由此提示Tau的SUMO化和泛素化之间具有某种特定相关性。同时Tau在SUMO化修饰后是否影响其聚积尚不得而知。 目的：探讨SUMO-1对Tau的降解及聚积过程的影响及其机制。 方法：在细胞水平,在稳定表达HEK293/Tau细胞系中先转染SUMO-1质粒,然后用cycloheximide(GFX)处理进行蛋白质降解实验,利用免疫印迹技术检测Tau的降解情况及其机制。同样,在HEK293/wt细胞系中共瞬时转染Tau和SUMO-1质粒,再用GFX处理检测Tau的降解情况。同时在上述过表达Tau、突变Tau K340R和SUMO-1时提取可溶性与不可溶性Tau,检测Tau的聚积情况。 结果：(1)过表达SUMO-1时Tau的降解受到抑制,当Tau蛋白第340位点由赖氨酸突变为精氨酸时,过表达SUMO-1后其降解有所增加。(2)无论是在293WT还是在293/Tau细胞中,过表达SUMO-1时Tau的泛素化均受到抑制。(3)过表达SUMO-1时,不可溶性Tau表达增多,而Tau的SUMO化位点突变后不可溶性Tau表达下降。 结论：Tau在过表达SUMO-1时通过抑制泛素的表达,减少tau的多聚泛素化,可能进而阻遏泛素化的NFTs或异常过度磷酸化的Tau被蛋白酶小体识别,抑制其降解。Tau的SUMO化还可增加其聚积。