背景：我科从上世纪90年代就着眼于中药抗肿瘤复发转移的研究。单纯的采用扶正的健脾益肾冲剂虽能有效改善肿瘤患者的生活质量,但在抑制肿瘤术后复发转移方面疗效有待提高。在此基础上,增加了清热解毒抗癌中药在处方中的比例,组成了扶正解毒方,采用此方治疗晚期胃肠癌患者取得良好疗效。扶正解毒法成为抑制肿瘤术后复发转移的重要治则。前期原发瘤模型实验已证实,扶正解毒中药联合化疗药物5-FU,不仅可以抑制小鼠肿瘤细胞远处肺、淋巴结转移,还可以有效地延长生存期,其原因同重塑肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤微环境中免疫抑制及促肿瘤转移作用具有一定的相关性,但具体的分子机制有待进一步深入探讨。本研究是在前期实验基础上,进一步从术后复发模型方面研究扶正解毒中药抑制肿瘤复发转移的分子机理。
方法：造模：建立移植性前胃癌615小鼠术后复发转移模型(参照已完成的国家自然基金课题N0.30271656中的方法),同时设立空白对照组(Normal、Normal-operation)、模型组(Untreated)、中药组(FZJD-treated)、化疗组(5-FU-treated)、中西医结合组(5-FU+FZJD).空白对照组为没有接种肿瘤细胞组,其他均为接种肿瘤细胞组。观察：扶正解毒中药对前胃癌615小鼠术后复发模型的局部复发率,远处肺、淋巴结转移率、生存期影响及基于肿瘤相关巨噬细胞的分子机制。检测：获取各组小鼠脾脏、肿瘤、淋巴结。采用RT-PCR方法检测肿瘤及转移淋巴结中相关细胞因子CCL3、CCL22, iNOS. Arg-I的表达；用FACS检测脾脏、肿瘤中M1、M2型巨噬细胞所占比例；ELISA检测小鼠血清中相关细胞因子IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β分泌水平；Western blot检测肿瘤组织及转移淋巴结中PTEN、PI3K、Akt、mTOR, HIF-1α TGF-β LYVE-1的表达情况。
结果：
1.局部肿瘤原位复发率、复发瘤均重、复发率抑制率、复发瘤重抑制率
复发率：模型组>中药组>化疗组>中西医结合组,其中模型组最高,中西医结合组最低。复发率抑制率中药组42.83%、化疗组50%、中西医结合组80.95%。平均复发瘤重：模型组>化疗组>中药组>中西医结合组；平均瘤重抑瘤率,中药组64.55%,化疗组48.18%,中西医结合组89.09%。
2.肿瘤远处肺、淋巴结转移率及转移抑制率
肺转移：转移总数比较：模型组>中药组>化疗组>中西医结合组；肺转移抑制率中西医结合组最高(50.07%),中药组(33.33%),化疗组(27.08%)。
淋巴结转移：转移总个数比较：模型组>中药组>化疗组>中西医结合组；转移抑制率：中西医结合组(75.80%)>化疗组(38.19%)>中药组(30.64%)。
3.移植性前胃癌615小鼠术后复发模型生存期及生存期延长率
生存期的比较：中西医结合组>化疗组>中药组>模型组。模型组中位生存期45.83天、中药组49.23天,化疗组51.27天,中西医结合组53.58天。生存期延长率：中西医结合组达16.91%,化疗组11.87%,中药组7.42%。
4.肿瘤、脾脏组织中肿瘤相关巨噬细胞的表达影响
肿瘤组织中M1型巨噬细胞含量明显低于M2型巨噬细胞。给予药物干预后,M2型巨噬细胞明显下调,M1型巨噬细胞上调,下调幅度优于上调幅度。M2型巨噬细胞,模型组最高3.33±0.75(%),与中西医结合组比较,(P=0.036<0.05),有统计学差异。M1型巨噬细胞,模型组最低0.58±0.28(%),与中药组、化疗组、中西医结合组比较有统计学差异(P<0.05)。
脾脏组织中接瘤组M2型巨噬细胞表达量明显高于非接瘤组。模型组含量最高,可高达20.02±0.50(%)。中西医结合组表达下调至13.42±3.96(%),与模型组、中药组、化疗组比较有统计学差异(P<0.05)；M1型巨噬细胞中模型组含量最低,与各组比较有统计学差异(P<0.05)。药物干预后,M1型巨噬细胞表达含量上调,其中中西医结合组表达含量最高,至44.29±2.94(%)。
5.移植性前胃癌615小鼠术后复发模型血清中TAM相关炎性因子的影响
四种细胞因子的表达含量,接瘤组均高于非接瘤组,模型组高于其他组。其中IL-4,模型组>中药组>化疗组>中西医结合组,模型组与中西医结合组比较(P=0.04<0.05)；IL-10,模型组>中药组>化疗组>中西医结合组,组间未作出明显差异；IL-13,模型组>化疗组>中药组>中西医结合组,模型组与其他各组比较(P<0.05)；TGF-β,模型组>化疗组>中药组>中西医结合组,模型组与其他各组比较(P<0.05),中西医结合组与中药组、化疗组比较,(P<0.05)。
6.肿瘤、转移淋巴结中TAM相关趋化因子及特异基因mRNA表达的影响
复发瘤中,模型组高表达Arg-1、CCL22,低表达CCL3、iNOS.中西医联合干预后Arg-1、CCL22表达水平下降,CCL3、iNOS上调。但是扶正解毒中药对Arg-1、CCL22有异常明显的上调趋势,需进一步研究；淋巴结表达趋势同肿瘤组织,模型组亦高表达Arg-1、CCL22低表达CCL3、iNOS。中西医联合干预后Arg-1、CCL22表达水平较模型组下降,CCL3、iNOS表达水平上调。不同的是中药在淋巴结中未表达出对Arg-1、 CCL22明显的上调趋势。
7.肿瘤、转移淋巴结中相关转移通路信号蛋白的表达影响
复发瘤中,模型组高表达PI3K、HIF-1α、LYVE-1、mTOR,与其他组比较PTEN低表达。使用药物干预后PI3K、HIF-1α、LYVE-1、mTOR均有下降趋势。其中TGF-β、AKT、PTEN、PI3K, HIF-1α、LYVE-1、mTOR模型组与各组比较,(P<0.05)；TGF-β:中药组与模型组、中西医结合组比较(P<0.05); AKT中药组与各组比较,(P<0.05); TGF-β、HIF-1α、 LYVE-1:中西医结合组与与各组比较,(P<0.05); AKT:中西医结合组与模型组、中药组比较,(P<0.05)。
淋巴结中,模型组高表达TGF-β、AKT、PI3K、HIF-1α、LYVE-1. mTOR,与中西医结合组比较PTEN低表达。使用药物干预后TGF-β、AKT、PI3K, HIF-1α、 LYVE-1、mTOR均有下降趋势。其中TGF-β、AKT、PI3K、HIF-1α、LYVE-1:模型组与各组比较,(P<0.05); PTEN、LYVE-1:化疗组与各组比较,(P<0.05); AKT、 PTEN、HIF-1a:中西医结合组与中药、化疗组比较,(P<0.05); LYVE-1:中西医结合组与中药比较,(P=0.032<0.05); mTOR:中西医结合组与各组比较,(P<0.05)。
结论：扶正解毒方联合化疗能有效抑制局部肿瘤的原位复发率及生长,抑制远处肺、淋巴结转移,延长小鼠生存期。其作用机制可能是中药联合化疗药抑制HIF-1α介导的PTEN/PI3K/Akt/mTOR信号传导通路,下调M2型巨噬细胞相关细胞因子IL-4,IL-10, IL-13, TGF-β分泌,促使M2型向M1型巨噬细胞转化,降低肿瘤微环境中M2型巨噬细胞的浸润,改善局部肿瘤微环境,抑制血管、淋巴管生成,从而抑制肿瘤局部复发、远处转移。
