苏云金芽孢杆菌cry1le1和cry8基因的研究

cry1Ie1基因是我国鉴定分离并经国际命名的一种新型的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）杀虫晶体蛋白基因。该基因在Bt菌株中沉默，编码719个氨基酸组成的蛋白，对小菜蛾（Plutella xylostella）、玉米螟（Ostrinia furnacalis）和大豆食心虫（Leguminivora glycinivorella）等害虫具有较高的杀虫活性。本研究通过PCR扩增的方法，以cry1Ie1全长基因为模板，分别得到不同末端缺失的基因片段，转化大肠杆菌BL21（DE3）中，诱导表达，得到6种末端缺失的蛋白。通过对小菜蛾和玉米螟生物测定确定Cry1Ie1蛋白对小菜蛾的最小活性区N端在45-104氨基酸位点之间，C端在633-648氨基酸位点之间。N端的45个氨基酸对于玉米螟的杀虫活性的是必需的，而C端活性区应在633-648氨基酸位点之间。最终明确1-648氨基酸对小菜蛾和玉米螟均与全长蛋白活性相当或略高。 在上述研究基础上，对编码Cry1Ie1蛋白1-648氨基酸的核酸序列进行的序列改造和密码子优化，使其能在植物中高效表达。经过优化人工合成的cry1Iem基因与原基因的同源性只有82.8％，而G+C含量也由原来cry1Ie1的37.04％提高为47.22％。原核表达的Cry1Iem蛋白与Cry1Ie1活性相当。 苏云金芽孢杆菌cry8类基因对叶甲科、金龟科等多种鞘翅目害虫均具有毒杀作用。，本研究建立了cry8类基因的鉴定体系，从我国分离的36株Bt菌株中鉴定出15株含有cry8类基因，主要分为两种类型，RFLP图谱分析表明以HBF-1为代表的3株含有cry8Ca基因，而以185菌株为代表的12株含有新型cry8基因，进一步克隆了185菌株该基因的部分序列，发现与已知cry8基因序列存在较大差异。 克隆了菌株HBF-1和H06菌株中cry8Ca基因，它们之间只存在1个氨基酸的差异，在Bt菌株无晶体突变株HD-73-中获得高效表达，并对铜绿丽金龟（Anomala corpulenta）幼虫蛴螬有较高的杀虫活性，在160μg／g土土壤浓度下，14天校正死亡率达68.3％。从Bt菌株185中克隆一种新型的cry8基因。该基因与已知cry8基因的同源性均低于78％，已在GenBank登录（AY329081），并被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry8Ea1基因。这是我国发现的第一个第二等级的Bt杀虫基因，杀虫活性的研究正在进行。