柯萨奇病毒感染星形胶质细胞及细胞因子变化研究

研究目的和意义 柯萨奇病毒(Coxsackievirus)是引起人类感染的最常见的致病原之一,其感染可以导致许多疾病和症状,如呼吸道感染疾病,典型症状为疱疹性咽峡炎,手足口病,严重的心肌炎、心包炎及神经系统疾病。近年来在我国出现了几起暴发流行,以无菌性脑膜脑炎为主要特点。病人的脑脊液中促炎症细胞因子浓度出现异常升高。神经胶质细胞,尤其是小胶质细胞和星形胶质细胞是中枢神经系统(CNS)细胞因子产生的主要来源,但其在Coxsackievirus感染CNS时的功能仍不清楚。因此,本实验研究的主要目的在于探索星形胶质细胞在Coxsackievirus感染后所发生的病理变化及相关免疫反应如细胞因子变化,为明确胶质细胞在感染中的作用、理解CNS感染Coxsackievirus后的发病机制提供必要的实验依据。 运用基因克隆的方法构建趋化因子IP-10(CXCL10)真核表达载体,为进一步研究趋化因子IP-10的生物学功能提供帮助。 材料和方法 新生(<1d)的BALB/C小鼠,常规皮肤消毒,断头杀鼠,在无菌条件下迅速剥除硬脑膜,钝性分离脑组织制成混合细胞悬液。培养20-25天,用温和胰酶消化结合定轨摇床振荡的方法分离纯化星形胶质细胞。用Coxsackievirus中具有代表性的病毒Coxsackievirus A16和B3分别感染星形细胞,检测病毒复制、病毒生长曲线、细胞病变、细胞存活率、细胞因子基因转录水平及蛋白分泌变化。运用基因克隆的方法构建IP-10(CXCL10)真核表达载体,转染细胞使之过表达IP-10研究其对细胞生存状态的影响。 结果及结论 1.成功分离并纯化星形胶质细胞和小胶质细胞。采用免疫荧光和流式细胞技术检测纯度在90%以上,方法成熟可重复性高,满足实验要求。 2. Coxsackievirus B3可以感染星形胶质细胞并在其中增殖产生子代病毒。星形胶质细胞对Coxsackievirus A16不敏感,不能在其中有效复制产生子代病毒。 3. Coxsackievirus B3感染星形胶质细胞可引起明显的细胞病变效应(CPE),培养上清中的病毒滴度在24h内达到高峰。Coxsackievirus A16不引起星形细胞CPE出现。 4. Coxsackievirus B3感染可诱导星形胶质细胞的促炎症细胞因子IL-1、IL-6及TNF-α及趋化因子CCL5、IP-10的mRNA水平上调;Coxsackievirus A16同样可以引起星形胶质细胞的促炎症细胞因子IL-1、IL-6及TNF-α及趋化因子CCL5、IP-10的mRNA水平上调,但没有Coxsackievirus B3明显。 5. ELISA定量检测培养上清中的IP-10含量结果表明,与Coxsackievirus A16相比,Coxsackievirus B3感染星形胶质细胞能够诱导产生更多的IP-10,灭活的Coxsackievirus B3也可以诱导星形胶质细胞产生少量IP-10。 6.成功构建IP-10(CXCL10)真核表达载体,转染原代星形胶质细胞,使之表达IP-10。