Ihh-PTHrP信号轴对前软骨干细胞增殖、凋亡和分化的调控及机制研究

[研究目的] 本研究旨在明确Ihh和PTHrP双信号在大鼠来源前软骨干细胞中的表达情况；观察Ihh-PTHrP信号轴对细胞生命活动的影响；应用通路阻断和质粒转染的方法对Ihh和PTHrP信号的活性进行双向调节，通过基因水平、蛋白水平及细胞生物学功能的检测，试图揭示Ihh-PTHrP双信号单独或协同作用下对前软骨干细胞增殖、凋亡和分化的影响及其调控机制；同时对Ihh和PTHrP信号通路间的相互调节作用，以及通路可调控性、调控手段和调控效果进行较全面的评估。为构建具有可调控生长与分化能力软骨组织工程种子细胞提供实验依据。 [研究方法] 1．应用显微外科技术分离出生后不同周龄大鼠的股骨干骺端组织，通过HE染色观察大鼠干骺端软骨组织结构，用免疫组织化学染色观察Ihh和PTHrP双信号在不同发育程度干骺端软骨组织中的表达和定位情况。 2．应用显微外科和免疫磁珠筛选技术从大鼠软骨膜La Croix环处获得纯化的前软骨干细胞，并经免疫组化和免疫荧光进行FGFR3和ColⅡ表型鉴定。 3．应用Hh信号通路特异性阻滞剂cyclopamine以不同浓度抑制Ihh信号，通过PTHrP真核质粒(pEGPF-N1-PTHrP)转染增强PTHrP信号；设立对照组、单信号干预组和双信号干预组，研究Ihh-PTHrP双信号对前软骨干细胞的独立或协同调控作用及机制。 4．应用细胞RNA提取及RT-PCR技术，检测Hh蛋白家族以及Hh信号通路相关基因(Ihh、Shh、Dhh、Ptch和Smo)在前软骨干细胞中的表达情况；以及干预后信号通路相关基因(PTHrP、Ptch、Ihh、Smo)和增殖／凋亡相关基因(Bcl-2、p21)的表达变化：通过Western Blot检测信号蛋白(Ihh、PTHrP)的表达变化。 5．应用MTT和BrdU掺入法检测不同实验组细胞增殖和DNA合成情况，AnnexinV-PI流式细胞术检测细胞凋亡情况。 6．应用免疫组织化学和阿尔辛蓝染色法，观察干预后前软骨干细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达，观察细胞的分化情况。 [研究结果] 1．免疫组化显示，Ihh和PTHrP信号在大鼠干骺端发育过程中持续表达，且主要位于肥大软骨细胞层和次级骨化中心内。提示其活性与软骨内成骨过程中骨基质的形成密切相关。 2．成功获得了性状和表型一致的前软骨干细胞，经鉴定同时表达FGFR3和ColⅡ蛋白，符合前软骨干细胞表型特点。 3．PCR结果显示，Hh和PTHrP信号存在于PSCs中，且信号蛋白以Ihh亚型为主，Dhh和Shh表达微弱。阻断Ihh信号后，观察到前软骨干细胞失去原有形态出现老化现象。 4．经PCR和MTT检测，cyclopamine对于Ihh信号通路的抑制存在剂量和时间依赖关系；转染pEGPF-N1-PTHrP质粒后两周，目的基因在细胞内仍显著表达。提示上述方式均可以有效调控Ihh和PTHrP信号的活性。 5．在阻断Ihh信号的试验中还发现，PTHrP的基因和蛋白表达水平随Ihh的下降而下降；而在过表达PTHrP的试验中却发现Ihh的表达被抑制。提示Ihh可以促进PTHrP的表达，而PTHrP对Ihh可产生负反馈调节作用。 6．MTT和BrdU检测发现，Ihh信号阻断后前软骨干细胞的增殖活性受到明显抑制，AnnexinV检测提示其凋亡率增加，而过表达PTHrP信号不能纠正这一影响。提示Ihh信号的存在可促进前软骨干细胞的增殖并抑制其凋亡，这一调节作用不依赖PTHrP的存在。 7．通过基因表达检测发现，p21和Bcl-2可能参与介导Ihh对前软骨干细胞增殖和凋亡的调控，但具体机制有待进一步研究。 8．在细胞分化的研究中，Ihh信号抑制后和对照组比较ColⅡ的表达下降，ColⅩ表达升高，细胞外蛋白多糖的合成减少；而过表达PTHrP信号可以不依赖Ihh信号的存在发挥抑制前软骨细胞过分化的作用。提示Ihh信号对前软骨干细胞分化的调节是通过PTHrP信号介导的，而后者可以独立抑制前软骨干细胞的分化。 [结论] 通过上述研究，我们认为Ihh和PTHrP信号通路参与大鼠长骨干骺端软骨内成骨过程。在软骨膜来源的前软骨干细胞中也存Ihh和PTHrP信号通路，两者构成Ihh-PTHrP信号轴，并通过负反馈调节机制相互影响和制约，以独立或协同的方式对细胞的增殖和分化发挥关键性调节作用。一方面，Ihh信号的存在可以促进前软骨干细胞的增殖并抑制其凋亡，这一作用不依赖PTHrP信号而与p21和Bcl-2的表达相关；另一方面，Ihh可以通过PTHrP依赖的方式参与调节前软骨干细胞的分化。这些发现将有助于我们更好的理解前软骨干细胞生长分化的调控机制，为今后利用其进行组织工程软骨的构建打下理论基础。