电针膝眼穴调控RhoA/ROCK信号通路抑制膝骨性关节炎软骨退变的机制研究

目的通过动物实验和细胞实验,从Rho A/ROCK信号通路探讨电针膝眼穴抑制膝骨性关节炎软骨退变的作用机制,进一步探究电针延缓关节软骨退变的可能作用靶点。方法1.动物实验:采用改良Hulth手术法建立大鼠膝骨性关节炎模型,并随机分为5组,即正常组、模型组、电针膝眼组、电针非穴组和抑制剂组。正常组大鼠不做任何干预,模型组和抑制剂组于两电针组电针干预时给予同样的抓取和袜套固定15min,电针膝眼组给予内、外膝眼电针15min,电针非穴组给予电针非经非穴15min以作对照,抑制剂组大鼠每次腹腔注射0.1 ml Y-27632溶液,1天注射1次,每周连续注射5天,休息2天,连续注射12周。两组电针均设置为疏密波模式,脉冲输出频率为2/10 Hz,强度为0.5-1.5m A,以局部肌肉开始抽搐,大鼠不挣扎为度。1天干预1次,每周干预5天,共干预12周。干预完成后收集大鼠右侧膝关节软骨组织,采用HE染色和番红固绿染色观察各组软骨组织形态学变化,采用TUNEL法检测软骨细胞凋亡情况,采用实时荧光定量PCR和Western Blot检测软骨组织Rho A/Rock信号通路上Rho A、Rock、ERK1/2、Bax及Bcl-2等相关m RNA和蛋白表达情况。2.细胞实验:建立软骨细胞体外培养体系,Ⅱ型胶原和甲苯胺蓝染色法鉴定软骨细胞,MTT法检测第F1～F3代软骨细胞的生长情况,并绘制出生长曲线,优选软骨细胞。取长势良好的软骨细胞培养72后,随机分为空白组、模型组、电针膝眼组,电针非穴组和抑制剂组共5组。正常组:加入含10%正常组血清的培养基100ul;模型组:加入TNF-α20ng/m L+10%模型组血清培养基共100ul;电针膝眼组:加入TNF-α20ng/m L+10%电针膝眼组血清培养基共100ul;电针非穴组:加入TNF-α20ng/m L+10%电针非穴组血清培养基共100ul;抑制剂组:加入TNF-α20ng/m L+抑制剂Y-27632 10u M+10%模型组血清培养基共100 ul。各组干预后,采用CCK-8法检测软骨细胞活性,Annexin V流式细胞仪检测软骨细胞凋亡情况,采用实时荧光定量PCR及Western blot法检测软骨细胞Rho A/Rock信号通路上Rho A、Rock、ERK1/2、Bax及Bcl-2等相关m RNA和蛋白表达情况。结果1.动物实验:HE染色、番红固绿染色结果显示:电针膝眼组和抑制剂组的关节软骨组织形态均较模型组或电针非穴组有明显改善,而电针膝眼组和抑制剂组两组间的差异不明显。TUNEL检测结果显示:与模型组或电针非穴组相比,电针膝眼组和抑制剂组可明显降低软骨细胞凋亡指数(P<0.05),电针膝眼组和抑制剂组两组间的差异无统计意义(P>0.05)。实时荧光定量RCP及Western Blot结果显示:与模型组或电针非穴组比较,电针膝眼组和抑制剂组均显著下调了Rho A、Rock、ERK1/2、bax等关键基因和蛋白的表达水平,上调Bcl-2的基因和蛋白表达水平,差异均具有显著性意义(P<0.01),而电针膝眼组和抑制剂组两组间的差异无统计意义(P>0.05)。2.细胞实验:软骨细胞经Ⅱ型胶原染色可见胞浆被异染为棕黄色颗粒,呈片状或团块状;甲苯胺蓝染色,胞浆内呈紫红色异染颗粒。根据第F1～F3代软骨细胞生长曲线特点,优选出第F2代软骨细胞铺板后第3～6d内进行细胞实验。20ng/ml浓度干预4 h是TNF-α诱导软骨细胞凋亡的最佳量效和时效。各组干预后,电针膝眼组和抑制剂组的软骨细胞活力均明显高于模型组或电针非穴组(P<0.05),但电针膝眼组与抑制剂组比较,差异无统计意义(P>0.05)。流式细胞术检测结果示:电针膝眼组和抑制剂组的总凋亡率均明显低于模型组或电针非穴组(P<0.05),电针非穴组和模型组的总凋亡率差异无统计意义(P>0.05)。说明TNF-α干预软骨细胞后能显著促进软骨细胞凋亡(P<0.01),而电针膝眼后血清能够抑制TNF-α诱导的软骨细胞凋亡。实时荧光定量RCP及Western Blot结果显示:电针膝眼组和抑制剂组软骨细胞的Rho A、Rock、ERK1/2、Bax等基因及蛋白表达水平均明显低于模型组或电针非穴组(P<0.05);电针膝眼组软骨细胞的Bcl-2基因、蛋白表达及Bcl-2/Bax比值则明显高于模型组或电针非穴组。电针膝眼组与抑制剂组之间,以及电针非穴组与模型组之间的Rho A、Rock、ERK1/2、Bax、Bcl-2基因及蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。结论1.电针膝眼穴能够有效减轻膝骨性关节炎对大鼠软骨组织形态的损伤程度,电针膝眼穴通过调控Rho A/Rock信号通路,下调软骨组织中Rho A、Rock、ERK1/2、bax等关键基因和蛋白的表达水平,上调Bcl-2的基因和蛋白表达水平,抑制关节软骨细胞凋亡,减轻软骨破坏,维持软骨结构的相对完整性,从而达到延缓关节软骨退变的作用。2.电针膝眼后血清通过抑制软骨细胞Rho A/Rock信号通路的传导,下调软骨细胞Rho A/Rock通路上Rho A、Rock、ERK1/2、Bax等基因及蛋白的表达水平,上调Bcl-2基因及蛋白的表达水平,从而起到抑制软骨细胞凋亡、延缓软骨细胞退变的作用。