益气解毒活络法对早期糖尿病肾病大鼠TGF-Smads-UPP通路的影响

目的：通过观察益气解毒活络中药复方对链脲佐菌素（STZ）所致早期糖尿病肾病（DN）大鼠一般状况的影响；探讨益气解毒活络中药复方抑制糖尿病模型大鼠肾组织中TGF-β1（转化生长因子）过度表达的具体机制，即研究益气解毒活络中药复方对早期DN大鼠TGF-Smads-UPP（泛素-蛋白水解酶复合体通路）信号通路的干预作用，进一步明确益气解毒活络中药复方防治早期糖尿病肾病的分子机制。 材料与方法： 1.益气解毒活络中药对早期DN大鼠的干预作用 SPF级健康雄性SD大鼠72只，适应性饲养一周，按体重随机分为6组：正常对照组（A）、模型空白组（B）、中药预防组（C）、中药低剂量治疗组（D1）、中药高剂量治疗组（D2）及阳性西药对照组。正常对照组予普通饲料喂养，其余5组予高糖高脂饲料喂养。4周后各治疗组大鼠予尾静脉注射STZ35mg/kg，正常对照组予尾静脉注射等量生理盐水。72小时后测大鼠空腹血糖，≥16.7mmol/L确定为DM模型成模。再根据大鼠血糖值高低对各治疗组进行随机分组。益气解毒活络中药复方选用中药颗粒剂溶于蒸馏水中。各治疗组每日用药量按大鼠-人体（g/kg）的等效剂量6.3倍计算；中药高剂量治疗组的用药量为中药低剂量治疗组的3倍。正常对照组、模型空白组大鼠予2毫升/日生理盐水灌胃。中药预防组在成DM模型后立即给予灌服益气解毒活络中药复方，每日1次，共计给药6周；中药低剂量治疗组、中药高剂量治疗组及阳性西药对照组均在成DM模型2周后，即成DN模型后灌服中药复方，每日1次，共计给药4周。分别在灌服中药2周末、4周末收集大鼠24小时尿液待测尿微量白蛋白；4周后行腹主动脉穿刺取血检测大鼠血糖、糖化血红蛋白、血β2微球蛋白水平；光镜下观察大鼠肾脏组织病理形态学改变。 2.益气解毒活络中药对早期DN大鼠TGF-β1基因及蛋白表达的影响 在DN模型成模4周末，留取肾组织标本，观察益气解毒活络中药对早期DN大鼠肾组织TGF-β1mRNA（RT-PCR法）及蛋白表达（Western-blot法）的影响。 3.益气解毒活络中药对早期DN大鼠TGF-Smads-UPP信号传导通路的影响 在成功复制DN模型4周末留取肾组织标本，观察益气解毒活络中药对早期DN大鼠肾组织Smad3和Smad7mRNA（RT-PCR法）及蛋白表达（Western-blot法）；Smurf1、Smurf2mRNA（RT-PCR法）及蛋白表达（Western-blot法）；肾组织26S蛋白水解复合体酶活性（ELISA法）的影响，进一步探讨其对早期DN可能的作用机制。 结果： 1.益气解毒活络中药对早期DN大鼠的干预作用 1.1各组大鼠体重的比较 在DN模型成模4周末，模型空白组大鼠体重下降明显，与正常对照组比较差异显著（P＜0.01）；经药物干预后各治疗组大鼠体重明显增加，与模型空白组比较有显著差异（P＜0.01），中药预防组效果最为明显。 1.2各组大鼠24小时尿微量白蛋白含量的比较 在DN模型成模4周末，模型空白组大鼠24小时尿微量白蛋白含量明显上升，与正常对照组比较差异显著（P＜0.01）；经药物干预治疗后各治疗组大鼠24小时尿微量白蛋白含量显著降低，与模型空白组比较差异显著（P＜0.01），中药高剂量治疗组和阳性西药对照组效果最为明显。 1.3各组大鼠空腹血糖的比较 在DN模型成模4周末，模型空白组大鼠空腹血糖显著升高，与正常对照组比较差异显著（P＜0.01）；各治疗组大鼠在药物干预治疗后空腹血糖明显降低，与模型空白组比较差异显著（P＜0.01），中药预防组效果最为明显。 1.4各组大鼠糖化血红蛋白水平的比较 在DN模型成模4周末，模型空白组大鼠糖化血红蛋白水平显著增高，与正常对照组比较差异显著（P＜0.01）；各治疗组大鼠糖化血红蛋白水平明显下降，与模型空白组比较差异显著（P＜0.01），其中中药高剂量治疗组效果最为明显。 1.5各组大鼠血β2微球蛋白含量的比较 在DN模型成模4周末，模型空白组大鼠血β2微球蛋白含量显著增高，与正常对照组比较差异显著（P＜0.01）；各治疗组大鼠经药物干预治疗后，血β2微球蛋白含量与模型空白组比较均显著降低（P＜0.01），其中阳性西药对照组效果最为明显。 1.6肾脏病理形态学观察 光镜下正常对照组肾小球结构完整，未见细胞增生，毛细血管基底膜（GBM）、系膜区、细胞外基质（ECM）未见异常改变；模型空白组可见肾小球肥大，GBM增厚，系膜细胞增生、系膜区增宽，部分肾小管上皮空泡变性，肾小管萎缩；各治疗组经药物干预治疗后上述病理改变均有不同程度的改善，与模型空白组比较显著减轻。 2．益气解毒活络中药对早期DN大鼠TGF-β1基因及蛋白表达的影响 正常对照组大鼠4周末肾皮质TGF-β1mRNA仅微弱表达，模型空白组TGF-β1mRNA表达较正常对照组有明显提高（P＜0.01）。与模型空白组比较，各治疗组TGF-β1mRNA表达显著下调（P＜0.05），中药预防组下调最为显著。 检测到正常大鼠肾组织匀浆可见少量TGF-β1蛋白表达，与正常对照组比较，模型空白组大鼠TGF-β1蛋白表达提高显著（P＜0.01）。与模型空白组比较，各治疗组TGF-β1蛋白表达水平下调明显（P＜0.01），中药预防组作用最为明显。 3．益气解毒活络中药对早期DN大鼠TGF-Smads-UPP（泛素-蛋白水解酶复合体通路）信号传导通路的影响 3.1对肾组织Smad3、Smad7mRNA及蛋白表达的影响 正常对照组大鼠4周末肾皮质Smad3mRNA仅微弱表达，模型空白组Smad3mRNA表达较正常对照组有明显提高（P＜0.01）。与模型空白组比较，各治疗组Smad3mRNA表达显著下调（P＜0.01）。中药预防组、中药低剂量治疗组的Smad3mRNA表达下调最为明显。 正常对照组4周末大鼠肾皮质Smad7mRNA表达显著，模型空白组Smad7mRNA表达较正常对照组有明显降低（P＜0.01）。与模型空白组比较，中药高剂量治疗组、中药低剂量治疗组表达水平均明显上调（P＜0.05），与阳性西药对照组比较无显著差异。治疗组间，中药预防组的Smad7mRNA表达最增强。 模型空白组大鼠肾组织中的Smad3蛋白表达与正常对照组比较明显增强，差异显著（P＜0.01）；模型空白组大鼠肾组织中Smad7蛋白表达水平与正常对照组比较明显下降，差异显著（P＜0.01）；与模型空白组相比较，各治疗组可明显下调肾组织中Smad3蛋白的表达水平（P＜0.01）；上调肾组织中Smad7蛋白的表达水平，其中中药预防组效果最为明显（P＜0.01）。 3.2对肾组织UPP特异信号蛋白Smurf1、Smurf2mRNA及蛋白表达的影响 正常对照组大鼠4周末肾皮质Smurf1、Smurf2mRNA仅微弱表达，模型空白组Smurf1、Smurf2mRNA表达较正常对照组明显上调（P＜0.01）；中药各治疗组和阳性西药对照组与模型空白组比较Smurf1、Smurf2mRNA表达水平均显著下调（P＜0.01）；其中中药预防组的下调作用最为明显。 Western-blot结果显示，大鼠肾组织中可检测到Smurfl、Smurf2的蛋白表达；与正常对照组比较，模型空白组Smurfl、Smurf2的蛋白表达明显增强（P＜0.01）。与模型空白组比较，各治疗组用药4周后Smurfl、Smurf2的蛋白表达水平均明显下调（P＜0.01），其中中药预防组及阳性西药对照组下调幅度大于其他各用药组（P＜0.01）。 3.3对肾组织26S蛋白水解复合体酶活性的影响 4周末正常对照组大鼠肾组织26S蛋白水解复合体酶活性较高，模型空白组较正常对照组比较水平明显降低（P＜0.01）。与模型空白组比较，各治疗组26S蛋白水解复合体酶活性水平升高明显（P＜0.01），中药预防组与各治疗组比较升高最为明显（P＜0.01）。 结论： 1.益气解毒活络中药复方能改善DN大鼠的一般状况，减少尿蛋白的排泄，对早期DN大鼠的体重、24h尿微量白蛋白含量、血β2微球蛋白含量、空腹血糖水平、糖化血红蛋白水平及肾脏组织病理形态学改变均有明显改善，能够有效防治早期大鼠DN。 2.益气解毒活络中药复方防治早期DN大鼠的作用机制是通过抑制TGF-β1mRNA及蛋白表达，调节Smad3、Smad7mRNA及蛋白表达以及UPP特异信号蛋白Smurf1、Smurf2mRNA及蛋白表达，升高26S蛋白水解复合体酶活性而发挥防治效果。 3.早期糖尿病肾病病理机制TGF-β1的过度表达与TGF-Smads-UPP信号传导通路密切相关。