人TIM-1基因的表达调控机制研究及TIM-1基因多态性与中国汉族人群哮喘的相关性研究

支气管哮喘是由多种炎症细胞(如嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞)及细胞因子参与的气道慢性炎症性疾病,主要表现为气道高反应性、气道阻塞、气道炎症和气道重构。临床上以反复发作的咳嗽、胸闷和呼吸困难为主要表现,可自愈或经药物缓解。 遗传流行病学研究表明支气管哮喘是遗传和环境因素共同作用而引起的复杂疾病。目前已经发现许多染色体区域与哮喘或哮喘相关表型连锁,并在这些连锁区域内确定了多个哮喘易感基因。5q31-33是一个重要的哮喘易感基因候选区域,已经在多个人群中得到证实,人类TIM基因家族即位于这一区域而且是利用小鼠模型通过定位克隆分离到的哮喘易感基因。 支气管哮喘作为一种多基因遗传的免疫相关疾病,以Th1/Th2细胞平衡失调为主要特征,存在向Th2细胞的免疫偏离。功能上与Th1/Th2细胞诱导及分化相关的基因可能通过影响Th1/Th2细胞的诱导与分化引发或者促进Th1/Th2平衡失调从而在哮喘发生中起作用。最近的研究发现人类TIM基因家族成员可能参与CD4+T细胞的分化与增殖,是一类可能影响Th1/Th2平衡的哮喘候选基因。 人类TIM基因家族包括三个成员TIM-1,TIM-3和TIM-4,编码一类T细胞表面具有共同基序的Ⅰ型跨膜糖蛋白。自TIM基因家族发现以来,对该基因家族成员在哮喘发生中的作用及其与哮喘的相关性研究成为热点。TIM-1是第一个被发现的TIM家族成员,它选择性的表达于CD4+T细胞表面,并持续优先在Th2细胞表达。可见TIM-1的表达在哮喘的发生过程中发挥重要的作用。但是目前对TIM-1的表达调控机制知之甚少,TIM-1基因多态性在中国汉族人群哮喘发生中的作用也不明确。为此,本课题我们进行了以下两方面的研究： 第一部分人TIM-1基因的表达调控机制研究 人类TIM-1基因的基因组DNA全长约29kb,其mRNA有两种转录本,分别包含8个和9个外显子。人TIM-1分子主要在人T细胞、肝脏和肾脏中表达,在脾脏和胸腺中也有少量的表达,而在心脏和肺中不表达。TIM-1基因的表达能够引起包括哮喘在内的一些免疫性疾病的发生。 为明确TIM-1基因表达调控机制,本课题首先采用MatInspector软件对NCBI数据库提供的人类TIM-1基因翻译起始点上游约2Kb序列进行分析,筛选潜在的顺式作用元件。根据基因组序列设计引物,利用不含启动子和增强子的报告基因分析系统pGL3-basic载体,将人类TIM-1基因编码序列上游2 Kb范围内的系列截短片段分别克隆到pGL3-basic载体报告基因上游,通过构建一系列含人类TIM-1基因上游序列的荧光素酶表达载体,,以检测这些片段的启动子活性。并进一步构建了三种点突变荧光素酶表达载体,即分别突变E2F4核心序列的TIM1-E2F4- Mut、突变Spl核心序列的TIM1-Sp1-Mut以及突变GFI1核心序列的TIM1-GFI1-Mut载体。以PRL-TK为内参照质粒(pRL-TK质粒含有海肾荧光素酶报告基因,用来校正转染效率),利用转染试剂LipofectamineTM 2000,将构建的表达载体以及阴性对照pGL3-basic瞬时转染Chang Liver和293T细胞株,24h后收集细胞,通过双荧光素酶报告基因检测系统定量分析启动子活性；并采用电泳迁移率实验(EMSA)进一步明确鉴定的顺式作用元件与反式作用因子之间的相互作用。取得了如下结果： 第一、双荧光素酶报告基因检测系列截短载体的结果显示,TIM-1基因的表达活性有三个较大的落差,分别位于在-98bp至-28bp之间、-28bp至-9bp之间和+422bp至+458bp的三个区域,表明这三个区域内存在人类TIM-1基因的主要表达调控元件。MatInspector软件分析发现三个区域内分别含有重要的表达调控元件E2F4、Spl和GFIl结合元件。 第二,为证实E2F4、Spl和GFI1结合位点的作用,我们采用PCR的方法将三个结合元件的核心序列做了突变,构建了突变型表达载体。对比分析野生型和突变型表达载体荧光素酶表达活性发现,突变结合位点核心序列可导致表达载体荧光素酶表达活性显著降低,突变载体的转录活性接近不含结合位点的载体活性。证实这三个位点是人类TIM-1基因基本启动子功能所必需的； 第三,为进一步证实E2F4、Spl和GFI1在人类TIM-1基因基本启动子活性中的作用,我们采用EMSA方法,在体外检测了E2F4、Spl和GFI1与DNA的结合情况。结果显示标记的野生型探针能特异结合核蛋白形成DNA-蛋白质复合物,非标记野生型探针能有效竞争复合物的形成,而非标记突变型探针无明显竞争作用。证明该区域的E2F4、Spl和GFI1结合位点能与细胞内E2F4、Spl和GFI1蛋白特异结合。 综上所述,本课题通过缺失和点突变分析发现调控人类TIM-1基因基本启动子活性的顺式作用元件是位于-98bp至-28bp之间的E2F4、位于-28bp至-9bp之间的Spl结合位点和位于+422bp至+458bp之间的GFI1结合位点,EMSA分析证实这三个位点能特异性结合转录因子。这三个顺式调控元件是人类TIM-1基本启动子活性所必需的。 第二部分TIM-1基因多态性与中国汉族人群哮喘的相关性研究 如前所述,无论是TIM-1所在位置还是其表达模式和功能都提示该基因可能在哮喘发生中发挥重要作用。本实验室的前期研究工作中,通过对TIM-1基因内部的三个SNP及TIM-1基因上游调控区域的两个SNP的研究发现,位于TIM-1基因上游调控区域的一个功能性SNP与汉族人群哮喘存在相关性。 为鉴定TIM-1基因内导致哮喘易感的功能位点,,我们在TIM-1基因内选择了rs4235719、rs1553318、rs953568、rs1039438和rs6878732等5个SNP,其中rs4235719为位于基因上游调控区域的SNP；rs1553318和rs953568均为位于基因第四内含子的SNP;rs6878732和rs1039438是根据HapMap中HCB的数据得出标签SNP,各自代表着一个不同的连锁不平衡板块。利用病例-对照研究方法分析这五个SNP多态位点与中国汉族人群哮喘之间的相关性。 收集中国汉族哮喘患者及正常对照个体外周血,提取基因组DNA。收集的哮喘患者均符合支气管哮喘的诊断标准,共569例；正常对照个体均无哮喘及其它过敏性疾病症状与病史,排除肝、肾疾病等,共578例。用PCR-RFLP的方法对TIM-1基因的SNP位点分型。针对没有合适酶切位点的SNP,通过PIRA-PCR的手段,利用错配引物引入合适的酶切位点。根据琼脂糖凝胶电泳结果确定个体基因型,并计算各位点在哮喘组和对照组中的基因型频率及等位基因频率。 根据Hardy-Weinberg平衡定律计算各多态位点在哮喘组和对照组的预期基因型频率,采用卡方检验进行组间比较。经过统计学分析,五个位点的基因型频率分布在患者组与对照组均符合Hardy-Weinberg平衡。采用卡方检验比较各多态位点在哮喘组与对照组的基因型与等位基因频率差异,检验多态位点与哮喘的相关性。发现： 1.TIM-1基因rs4235719、rs1553318、rs953568、rs1039438及rs6878732五个多态位点在中国汉族人群中具有多态性。这五个多态位点基因型频率及等位基因频率在哮喘组与对照组之间无显著性差异,提示它们与中国汉族人群哮喘无相关性,但不排除TIM-1基因其它多态位点可能与中国汉族人群哮喘相关,还需要对另外的一些位点进行功能分析来鉴定它们在哮喘发生中的作用。 2.对实验室前期研究的五个SNP位点在扩大的样本中进行分型,分型数据与前期研究数据综合。分析结果进一步证实多态位点rs41297579、rs6149307、rs45439103和rs34670839与中国汉族人群哮喘发生无显著相关,而rs9313422位点与中国汉族人群哮喘相关(P=0.0004)。 3.利用SHEsis软件对TIM-1基因十个多态位点进行单体型构建,得到的3种单体型中,单体型hapl和hap3的频率在哮喘组与对照组间有显著性差异,携带单体型hap3增加哮喘发生风险(OR：2.001,95%CI：1.492-2.686)。