丹参酚酸类成分生源合成的调控研究

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为我国传统中药,不仅具有活血化瘀、通经活络之功效,而且在心绞痛、心肌梗塞等心脏疾病的治疗中也发挥了重要作用。20世纪90年代以来,以迷迭香酸(RA)和丹酚酸B(LAB)为代表的酚酸类成分被普遍认为是丹参发挥药效的活性物质基础,逐渐受到研究者们的关注。从结构上看,LAB是RA的二聚体,被认为是由RA衍生而来,然而其具体的生物合成途径还未见报道。与其它唇形科植物相比,丹参中LAB的含量异常丰富,是探究LAB的生物合成途径极具潜质的植物材料。 利用生物技术,采用诱导子诱导植物细胞合成有价值的次生代谢产物,与传统的化学提取相比,经济可行,且不易造成环境污染,具有光明的前景。丹参成熟的发根培养体系为通过生物或非生物诱导作用提高目标次生代谢产物的含量提供了稳定可靠的组织培养平台。本研究发现非生物诱导子茉莉酸甲酯(MeJA)和银离子(Ag+)均能在不同程度上激活丹参发根中酚酸类成分的生物合成。 MeJA (0.1 mM)诱导能同时显著提高丹参发根中RA和LAB的含量,分别由干重的3.25%提高到6.02%,2.94%提高到19.2%。对RA代谢途径上相关基因的转录水平进行监测,发现MeJA处理显著提高了苯丙氨酸裂解酶(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(C4H)、酪氨酸氨基转移酶(TAT)、对羟基苯丙酮酸还原酶(HPPR)和对羟基苯丙酮酸双氧化酶(HPPD)的表达水平;采用串联质谱(LC-MS/MS)分别对诱导组和对照组丹参发根中参与酚酸类成分生物合成的相关次生代谢产物进行了含量测定。 在此基础上,将基因表达与代谢物积累的数据进行整合,构建了两者的典型相关谱,筛选出了与酚酸类成分(RA和LAB)合成直接相关的基因。以此为依据,分别构建了关键酶基因C4H、TAT和HPPR的单基因过量表达载体,旁路酶基因HPPD的反义抑制表达载体,以及TAT-HPPR双基因共转化表达载体,并将其转化丹参发根。相关基因表达水平和次生代谢产物积累水平的检测结果显示,这些代谢调控策略均在不同程度上激活了RA生物合成途径,并成功提高了目标化合物LAB和RA的含量。其中共同过量表达TAT和HPPR效果最佳,LAB和RA的含量分别达到丹参发根干重的11.5%和10.5%,是空质粒载体转化发根的17.1倍和14.5倍,是非转化发根的3.3倍和4.4倍。首次通过代谢工程手段有效激活酚酸类成分生物合成途径,成功提高酚酸类成分含量,为实现代谢工程育种提供了一个成功的范例。 Ag+ (15μM)诱导不能使丹参发根中RA的含量得到有效积累,却大大提高了LAB的含量(由干重的5.38%提高到18.8%),且发现两者之间的含量积累水平在诱导处理后的每个时间点都表现出明显的竞争关系。测定该诱导子对RA代谢途径的相关基因表达和次生代谢产物积累的影响,结果显示RA代谢途径的激活,恰好与LAB的积累相关。基于此推测RA和LAB之间存在一个关键的合成途径,该途径在Ag+作用下能被大大激活,从而促进RA向LAB的转化。通过对重要中间代谢产物进行监测以及前体饲喂实验,进一步验证了假设的生物合成途径,并首次为“RA是合成LAB的前体化合物”这一假说提供了重要的证据。 RA作为丹参中具有重要药用价值的活性成分,其生物合成途径由两条平行的支路构成,彼此之间可能相互协调,是研究探索植物次生代谢调控机制的模式途径之一。该研究为植物重要次生代谢产物生物合成途径的调控提供了一种新的模式,无论是在胁迫诱导还是在基因调控水平上,都将帮助更加系统深入的理解RA生物合成代谢流的调控机制,将大大推动丹参酚酸类成分代谢工程的研究进展。