马齿苋提取物对大鼠酒精性脂肪肝的预防作用及机制探讨

脂肪变性是酒精性肝病最早和最常出现的损伤形式，长期酗酒者约90%以上可发展成脂肪肝。有研究者指出，脂肪肝并非一直以来人们所认为的是一种良性的疾病状态，如果不加以重视，它可在短期内发展为不可逆的肝损伤。近年来已有越来越多的证据表明，由于乙醇在肝细胞中的高能量代谢，肝细胞线粒体呼吸链功能亢进，使得细胞耗氧量增加，但是肝脏氧的运输却只是相对增加了很小的一部分，可导致中央静脉处于相对缺氧的状态，此时肝细胞对发生其他损伤变得更为敏感。而且，研究表明发生酒精性脂肪肝（Alcoholic fatty liver，AFL）后，肝细胞肿大压迫肝血窦造成窦隙变窄，使肝细胞缺血缺氧，长时间就会导致肝细胞变性和坏死，并促进肝纤维化的发生。已有调查资料证实，20%～40%的AFL患者可发展为肝纤维化，8%～20%患者可发展为肝硬化。由于酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化疾病的严重危害性和难治愈性，使得AFL的防治研究受到了广泛的重视。 然而，由于AFL的发病机制尚未完全明确，目前针对AFL仍缺少有效的靶向治疗手段。水飞蓟素作为一种保肝药物已应用于临床，其对于包括酒精性肝病在内的很多肝脏疾病都有较好的临床效果。但由于其水溶性差，口服后生物利用率低，使得其应用受限，2010年Hepatology杂志发表的美国肝病学会与美国胃肠病学会联合制定的酒精性肝病诊断与治疗指南中指出，水飞蓟素无论是对急性还是慢性酒精性肝病患者都没有产生令人信服的效果，仅限用于酒精性肝病的临床试验。而对于其他防治AFL的药物尚处于经验积累阶段。因此，对抗AFL药物的研究和开发变得尤为重要。 马齿苋（Portulaca oleracea L.）为马齿苋科马齿苋属植物，是我国卫生部划定的78种药食同源的野生植物之一。我们课题组前期研究结果表明，马齿苋提取物（ethanolextract from Portulaca oleracea，EEPO）对缺氧小鼠肝脏氧化应激损伤有一定的保护作用，并对小鼠肝脏缺血再灌注损伤具有显著的保护作用。且近年来的药理研究表明，马齿苋具有抗炎、抗氧化、降血脂等功能，并对化学性、药物性和急性酒精性肝损伤具有保护作用。以上研究提示，EEPO可能具有预防AFL的作用，因此，本课题对EEPO预防AFL的作用进行了观察，并在此基础上对其可能的作用机制进行了探讨。通过动物实验观察EEPO对AFL的预防作用，并在此基础上探讨EEPO抗AFL的作用机制，为将药食两用植物马齿苋开发成抗AFL保健食品或药物提供实验依据。 一、大鼠AFL模型的复制 1、实验动物分组及处理 雄性Wistar大鼠20只（购自上海西普尔-必凯公司），适应性喂养5天，按体重随机分为对照组和模型组。模型组每日上午按0.5ml/100g剂量灌胃52°白酒一次，并给予高脂饲料，对照组灌胃生理盐水，给予普通饲料。动物每晚八点之后禁食，至次日上午空腹灌胃后再给予饲料。每三天称一次动物体重以调整灌胃体积。连续75天后，称动物体重，用10%水合氯醛（0.3ml/100g）麻醉，腹主动脉采血，室温静置30min后以3000rpm离心20min，分离上层淡黄色血清，心脏灌流0.9%NaCl溶液，取全肝，并用滤纸吸干表面水分，称重。取最大叶相同部位固定于10%中性甲醛溶液，用于制备石蜡切片。 2、大鼠体重比的计算 肝体重比＝肝湿重（g）/体重（100g） 3、肝脂含量的测定 采用甘油三酯（triglycerides，TG）试剂盒提供的GPO-PAP酶法测定。 4、大鼠肝组织病理检查 常规HE染色：动物肝组织经固定、脱水、透明、浸蜡、包埋后切片、烤片、HE染色，光镜下观察肝组织病理改变。 5、大鼠血清TG、TC、ALT、AST的测定 血清TG、总胆固醇（total cholesterol，TC）分别采用试剂盒提供的GPO-PAP、CHOD-PAP酶法测定，血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）采用美国LACA血生化自动分析仪检测。 二、EEPO预防大鼠AFL的药效观察 1、EEPO及阳性对照药水飞蓟素的制备 EEPO由第二军医大学附属长海医院中医科提供，溶于0.5%羧甲基纤维素钠溶液中，配成低、中、高剂量的溶液，折合成生药量分别为1.8g/ml、3.5g/ml、7.0g/ml。 水飞蓟素，购自Sigma公司，溶于0.5%羧甲基纤维素钠溶液（0.5%sodiumcarboxymethyl cellulose solution，0.5%CMCS），配成20mg/ml的溶液。 2、实验动物分组及处理 雄性Wistar大鼠（购自上海西普尔-必凯公司）56只，体重（160～180）g。适应性喂养5天，按体重随机分为正常对照组、AFL模型组、溶剂（0.5%CMCS）对照组、阳性对照药水飞蓟素组、EEPO低（1.8g/100g）、中（3.5g/100g）、高（7.0g/100g）剂量给药组，每组8只。 所有大鼠于每晚八点开始禁食，次日早上按0.5ml/100g剂量，模型组、溶剂对照组、阳性对照组和各EEPO给药组空腹灌胃52°白酒一次，并给予高脂饲料，正常对照组空腹灌胃生理盐水，给予普通饲料。动物每晚禁食前等体积（1ml/100g）灌胃给药。每三天称一次动物体重以调整灌胃体积。连续75天，于末次给药后禁食12h，不禁水。标本的采集同第一部分。取最大叶相同部位固定于10%中性甲醛溶液，用于制备石蜡切片，取另一相同部位同样固定于10%中性甲醛溶液，用于制备冰冻切片，其余肝组织分装放入冻存管，置-80℃低温冰箱保存。 3、大鼠肝体重比的计算 方法同第一部分。4、肝脂含量的测定 方法同第一部分。 5、大鼠肝组织病理检查 常规HE染色：方法同第一部分。 脂肪染色：动物肝组织经固定、浸蔗糖去冰晶、OCT包埋后冰冻切片，切片厚度8μm，进行油红O染色，光镜下观察肝组织脂肪沉积情况并据诊断标准进行分级。 6、大鼠血清TG、TC、ALT、AST、GGT的测定 血清TG、TC、ALT、AST的检测方法同第一部分，血清γ-谷氨酰转移酶（γ-glutamyltransferase，GGT）亦采用美国LACA血生化自动分析仪检测。 三、EEPO预防AFL作用的机制探讨 （一）动物实验 1、实验动物分组及处理 实验动物分组及处理同第二部分。2、大鼠肝脏SREBP-1c、ACC、FAS、CPT-1、PPARα、HIF-1α mRNA表 达量的测定 采用实时定量荧光PCR法测定大鼠肝脏内固醇调节元件结合蛋白1c（sterolregulatory element-binding proteins1c，SREBP-1c）、乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoAcarboxylase，ACC）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）、过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome Proliferator-activated receptor，PPAR）α、肉碱软脂酰转移酶1（carnitinepalmityl transferase，CPT-1）及缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1α mRNA的表达水平。 3、大鼠肝脏ACC和磷酸化ACC蛋白含量的测定 Western blot法测定各组大鼠肝脏内ACC和磷酸化ACC的蛋白含量。 （二）细胞实验 1、含药血清的制备 雄性Wistar大鼠，重约120g左右，按体重随机分为对照组、EEPO组（7.0g生药/100g）和水飞蓟素组（200m/100g），每日两次分别灌胃同体积的0.5%CMCS、EEPO溶液和水飞蓟素溶液。连续十次，于最后一次灌药后1h（灌药前禁食不禁水12h），腹主动脉采血，3000rpm离心20min，吸取上层血清，经56℃30min灭活，无菌过滤后，置-20℃冰箱保存备用。 2、Arnt1siRNA转染细胞和EEPO干预 按说明书将Arnt1siRNA转染L02肝细胞后，加入不同体积的折合含生药5g/ml的除菌EEPO含药血清，对照组和阳性药物组则加入0.5%CMCS和Silymarin含药血清，使含药血清的最终体积浓度百分比分别为1%、2%、5%和10%，培养箱中培养12h。 3、L02肝细胞ACC、FAS、SREBP-1c mRNA表达量的测定 采用实时定量荧光PCR法测定L02肝细胞ARNT1、ACC、FAS、SREBP-1c mRNA的表达水平。 四、数据的统计与处理 实验数据采用SPSS16.0统计软件包进行统计分析。两组间比较采用t-检验；多组间采用单因素方差分析，各组间两两比较采用LSD检验和SNK-q检验；病理检查采用等级资料的秩和检验。实验数据以平均数±标准差（x±s）表示，P<0.05认为差异具有统计学意义。 结果 一、大鼠AFL模型的复制 1、大鼠体重比的比较 模型组肝体重比较对照组升高（P<0.05）。 2、大鼠肝脂含量的比较 模型组大鼠肝组织中TG含量较对照组明显增加（P<0.001；两组间TG含量差异的95%CI为（1.61，2.53）mmol/l）。 3、大鼠肝组织病理检查结果 光学显微镜下观察肝组织病理改变，结果显示，正常对照组大鼠肝细胞排列规则，边界清晰，结构正常；模型组大鼠肝细胞可见弥漫性的脂质空泡，大小不一，主要表现为大泡性脂变，细胞边界不清。 4、大鼠血清TG、TC、ALT、AST水平的比较 模型组大鼠血清TG、TC水平均较对照组升高（P<0.05），血清酶ALT与对照组比亦升高（P<0.05），AST则没有差异。 二、EEPO预防大鼠AFL的药效观察 1、EEPO对AFL大鼠体重和肝体重比的影响 实验结束时，各组间大鼠体重均没有差异（P>0.05）。AFL模型组和溶剂对照组大鼠肝体重比没有差异（P>0.05），但与正常对照组相比均有所升高（P<0.001）。给予低、中、高剂量EEPO后，大鼠肝体重比值较模型组和溶剂对照组均有不同程度的降低（P<0.001），分别降低了8.7%、13.0%、15.2%和12.5%、16.7%、18.8%；水飞蓟素组大鼠肝体重比则较模型组和溶剂对照组分别降低了10.9%、14.6%（P<0.001）；低、中、高剂量EEPO组与水飞蓟素组间均无差异（P>0.05）。 2、EEPO对AFL大鼠肝脂含量的影响 AFL模型组、溶剂对照组分别跟正常对照组相比，其大鼠肝组织中TG含量均有所升高（P<0.001），两组之间则无差别（P>0.05）。给予中高剂量EEPO干预的大鼠肝组织中TG含量较模型组和溶剂对照组有不同程度的降低（P<0.05）。水飞蓟素组大鼠肝组织中TG含量较模型组和溶剂对照组也有一定程度的降低（P<0.05）。 3、大鼠肝组织病理检查结果 光镜下观察肝组织病理变化，HE染色结果显示：正常对照组大鼠肝细胞结构正常，无脂质空泡。模型组则可见弥漫性的脂质空泡，主要为小泡性脂肪性变（近中央静脉处），肝细胞肿大，胞浆内挤满了微小脂泡，核仍在中央。给予不同剂量马齿苋提取物后脂变情况有一定程度的减轻，水飞蓟素对肝细胞脂变的影响与高剂量马齿苋提取物组程度相近。油红O脂肪染色结果亦表明，正常对照组大鼠肝细胞无红色脂肪滴，模型组则可见弥漫性的红色脂肪滴，肝细胞内挤满了红色的微小脂滴。给予不同剂量马齿苋提取物后红色脂滴数量有一定程度的降低。油红O染色结果同HE染色结果一致。 4、EEPO对AFL大鼠血清TG、TC、ALT、AST、GGT的影响 AFL模型组和溶剂对照组大鼠血清中TG、TC水平较正常对照组均有升高（P<0.001），两组间则无差别（P>0.05）。预防性给予不同剂量水平的EEPO后，大鼠血清中TG水平较模型组和溶剂对照组有不同程度的降低（P<0.001），而且，高剂量EEPO组TG与正常对照组间差别无统计学意义（P>0.05）；EEPO组跟模型组、溶剂对照组相比，血清TC同样有一定程度的降低（跟模型组比P值分别为0.012、0.000、0.000；跟溶剂对照组比P值分别为0.006、0.000、0.000）；EEPO三个剂量组间呈一定的剂量-效应趋势。水飞蓟素组血清TG、TC水平较模型组和溶剂对照组也有所降低（P<0.001）。各组间大鼠所测血清ALT、AST、GGT均无差别（P值分别为0.665、0.519、0.406，>0.05）。 三、马齿苋提取物预防大鼠酒精性脂肪肝作用的机制探讨 （一）动物实验 1、EEPO对AFL大鼠肝脏ACC、FAS、SREBP-1c、CPT-1、PPARα、HIF-1α mRNA表达量的影响 AFL模型组和溶剂对照组大鼠肝组织中ACC、FAS、SREBP-1c mRNA的表达量较正常对照组增加（P<0.001）。给予不同剂量EEPO干预可不同程度地下调AFL大鼠肝组织中ACC、FAS、SREBP-1c mRNA的表达（其中低剂量EEPO组跟模型组比，P值分别为0.009、0.001、0.790；中剂量组EEPO组跟模型组比，P值分别为0.000、0.000、0.011；高剂量组EEPO组跟模型组比，P值均为0.000）。水飞蓟素组大鼠肝组织中ACC、FAS、SREBP-1c mRNA表达量也是下降的（P值分别为0.002、0.031、0.000）。所有组间大鼠肝脏CPT-1、PPARα mRNA的表达量均无差别（P值分别为0.789、0.200，>0.05）。HIF-1α在AFL模型组和溶剂对照组大鼠肝组织的mRNA表达比正常对照组高（P<0.001），给予低中高剂量EEPO干预可降低其表达（跟模型组比，P值分别为0.002、0.000、0.000；跟溶剂对照组比，P值分别为0.018、0.000、0.000）。水飞蓟素组跟模型组、溶剂对照组相比，HIF-1α mRNA表达亦降低（P<0.001）。 2、EEPO对AFL大鼠肝脏ACC和磷酸化ACC蛋白表达量的影响 AFL模型组和溶剂对照组大鼠肝组织中ACC和磷酸化ACC蛋白的表达量与正常对照组相比均明显增加（P≤0.001，ACC差异的95%CI分别为（1.30，3.92）、（1.38，4.16），p-ACC差异的95%CI分别为（0.15，0.74）、（0.17，0.77）），但两组间大鼠肝组织ACC和磷酸化ACC蛋白的表达量均无统计学差异（P>0.05）。给予EEPO可不同程度地下调AFL大鼠肝组织中ACC和磷酸化ACC蛋白的表达（P<0.05），且呈剂量-效应趋势。 （二）细胞实验 1、ARNT1siRNA转染对L02肝细胞ARNT1mRNA表达的影响 结果表明，转染ARNT1siRNA的L02肝细胞ARNT1mRNA的表达量较未转染的对照组降低（P<0.05） 2、EEPO含药血清对转染ARNT1siRNA的L02肝细胞ACC、FAS、SREBP-1c mRNA表达的影响 未转染siRNA时，EEPO含药血清干预组L02肝细胞ACC、FAS、SREBP-1c mRNA的表达量较0.5%CMCS对照组降低（P<0.05），且呈现出一定的剂量-效应趋势；转染ARNT1siRNA后再给予EEPO含药血清干预，L02肝细胞ACC、FAS、SREBP-1c mRNA的表达量同样较0.5%CMCS对照组降低（P<0.05），且呈现出一定的剂量-效应趋势；分别给予等剂量EEPO的siRNA转染组与相应的未转染对照组相比，ACC、FAS、SREBP-1c mRNA的表达量则无统计学差异（P>0.05）。 结论 1、在饲喂高脂饲料的同时，每天定时定量给大鼠灌胃一定浓度的酒精，大鼠肝脏内出现脂质蓄积，肝脂含量增加，肝体重比增大，血脂水平升高，表明大鼠AFL模型复制成功； 2、EEPO可减少灌胃酒精联合饲喂高脂饲料大鼠肝脏内脂肪的蓄积，降低AFL大鼠肝脂含量，同时也可以降低其血脂水平，表明EEPO具有较好的预防AFL的作用； 3、EEPO预防AFL的可能作用机制与其下调肝细胞中促进脂肪合成信号通路上的关键酶ACC、FAS以及重要调控因子SREBP-1c的mRNA表达，降低脂肪酸合成限速酶ACC及磷酸化ACC的蛋白含量，从而抑制了肝脏脂肪酸的合成有关； 4、AFL大鼠HIF-1α的mRNA表达量增加，但EEPO对HIF-1α的影响还需要继续研究。由于AFL的发病机制十分复杂，EEPO为混合物，其预防AFL的作用可能是通过多个靶点来实现的，具体的作用机理仍需进一步研究。