SIRT1信号通路通过氧化应激参与大鼠慢性脑缺血致认知损伤的研究

血管性痴呆是发展中国家痴呆首要原因，迄今为止，人类还未找到治疗血管性痴呆行之有效的方法，防治手段十分有限。慢性脑缺血是研究血管性痴呆发病机理的重要组成部分，被认为是血管性痴呆、阿尔茨海默病等神经系统变性疾病、Binswanger病发病中的一个共同病理过程，可导致持久性进展性认知损伤，但其导致认识损害的病理生理机制仍不完全清楚，是丞待解决的医学难题。 信号转导系统功能失调及氧化应激在脑缺血、阿尔茨海默病等变性病所致痴呆中的重要作用已得到公认，临床上一些抗氧化剂已在痴呆的治疗中得到获益。细胞信号转导系统控制着细胞的生长、分化和死亡，参与调节细胞的活性。目前已知众多疾病都是由信号通路的缺陷所致。病理状态下信号通路的重构将有助于人们更多的了解疾病的病因和发病过程，同时提供了发现治疗疾病新方法的机会。 SIRT1（沉默信息调节因子1）是NAD+依赖性蛋白脱乙酰酶，在细胞分化、衰老、凋亡、生理节律、代谢调控、转录调节、信号转导、氧化应激等多种重要的生物学过程中发挥重要作用。最近的氧糖剥夺体外实验、急性脑缺血和缺血预处理动物实验表明SIRT1通过抗氧化、抗炎、减少凋亡等机制发挥神经保护作用，并有证据表明SIRT1是控制出生后血管生长的内皮细胞基因表达的关键调节因子，提示它可能在慢性脑缺血状态仍发挥重要作用。 为明确SIRT1信号通路在慢性脑缺血中的作用，本研究通过双侧颈总动脉永久性结扎法（双血管阻断，即2-VO）建立了慢性脑缺血的大鼠痴呆模型，利用Morris水迷宫检测大鼠的学习记忆能力，通过免疫组化和Wstern blot法检测慢性缺血时SIRT1在不同时间点的表达变化，并利用激活剂白藜芦醇及抑制剂EX-527对模型进行干预，利用免疫组化、实时定量PCR及Wstern blot检测SIRT1信号通路下游底物磷酸化FOXO3α（Ser253）、PGC-1α表达水平变化，及SIRT1信号通路对氧化应激的影响，最终为SIRT1信号通路的抗血管性认知损伤作用提供更多的理论依据。1慢性脑缺血大鼠模型制备及认知功能评价选用健康雄性Wistar大鼠，鼠龄2-3个月，体重260-300克，随机分为假手术6周组和慢性脑缺血6周组。采用双侧颈总动脉永久结扎(2-VO)法建立大鼠空间学习记忆障碍模型，利用Morris水迷宫检测大鼠的学习和记忆能力。定位航行试验中检测大鼠逃避潜伏期，每天进行2次试验，2次试验中间间隔15分钟，连续进行试验5天。第5天在定位航行试验结束后开始进行空间探索试验，检测大鼠跨越原平台所在象限时间。于2-VO术后6周对大鼠断头取脑，留取额叶皮层及海马组织，通过HE染色法进行病理学评估。实验结果显示2-VO大鼠死亡率为22.7%，与文献报道相近。术后6周定位航行试验显示，假手术组大鼠逃避潜伏期迅速下降并进入平台期，对隐藏平台的空间定位主要花费在前2天，而慢性脑缺血组则花费了4天时间学会寻找隐藏的平台，而且其学习能力并不稳定，表现为第5天的时候花费了更多的时间寻找隐藏的平台。空间探索试验中慢性脑缺血组大鼠跨越平台时间明显小于假手术组。HE染色镜下可见慢性脑缺血组大鼠额叶皮层和海马CA1区内散在缺血性改变，正常神经元数目减少，可见神经细胞脱失，组织排列紊乱，细胞形态不规则排列紊乱，出现神经元变性和死亡，散在嗜伊红细胞出现，细胞核固缩，核仁显示不清，核膜境界不清。假手术组大鼠组织结构完好，细胞排列整齐，无神经元凋亡、变性及坏死表现，胞质和核仁显示正常。以上结果提示本实验成功建立大鼠慢性脑缺血致认知损伤模型，双侧颈总动脉永久性结扎法可以较好的显示慢性脑缺血的行为学和病理学变化，并可造成显著认知损伤，模型可靠。2慢性脑缺血大鼠脑内SIRT1表达及氧化应激变化 将健康雄性Wistar大鼠分组如下：（1）假手术6周组（2）假手术9周组（3）假手术12周组（4）慢性脑缺血6周组（5）慢性脑缺血9周组（6）慢性脑缺血12周组。利用2-VO法建立慢性脑缺血模型，对额叶皮层和海马组织利用免疫组化染色及Western blot检测大鼠SIRT1蛋白表达水平。将海马和额叶制成10％的匀浆，离心后取上清液按试剂盒说明书进行SOD、MDA水平测定。 Morris水迷宫试验显示，在2-VO术后的6周、9周和12周，慢性脑缺血大鼠认知损伤随着缺血时间的延长呈现动态变化。术后6周定位航行试验显示慢性脑缺血大鼠在试验第2天、第3天和第5天逃避潜伏期明显长于假手术组。术后9周，在试验第2天至5天，慢性脑缺血大鼠的逃避潜伏期均显著长于假手术组，并在试验第4天即出现了逃避潜伏期再次延长。术后12周，慢性脑缺血大鼠逃避潜伏期在整个试验周期均明显高于假手术组。空间探索试验中3个时间点慢性脑缺血大鼠跨越原平台所在象限时间均明显小于假手术组，并随着缺血时间的延长逐渐缩短。慢性脑缺血HE染色病理切片显示随着缺血时间的延长，额叶和海马内神经元脱失及变性坏死逐渐增加，星形胶质细胞及血管增生逐渐增加，组织结构紊乱，排列不规则。细胞严重变形，胞质内有不均匀空泡逐渐增加，核固缩现象增多，白质区出现小软化灶。免疫组化结果显示SIRT1蛋白在细胞内主要表达于细胞核。2-VO术后SIRT1阳性细胞比率明显减少，以缺血6周组最明显。Western blot的检测结果显示2-VO术后6周、9周、12周SIRT1的蛋白水平均低于相应对照组，6周时SIRT1蛋白降低最明显，9周和12周时略有增加，12周高于9周，慢性缺血组各时间点之间SIRT1蛋白水平比较差异显著。2-VO术后6周、9周及12周氧化应激检测结果显示，慢性脑缺血时抗氧化物质SOD降低而脂质氧化标志物MDA升高，提示慢性脑缺血时体内抗氧化能力降低、氧化应激反应增强。慢性脑缺血组与假手术组之间SOD与MDA的显著差异均仅发生在脑缺血6周。以上结果提示2-VO模型可造成大鼠进行性认知损害，有效模拟血管性痴呆的临床经过。SIRT1活性在慢性脑缺血受到抑制，参与慢性脑缺血所致认知损伤的发生发展过程。慢性脑缺血时氧化应激反应主要发生在缺血6周的早期阶段，这为本实验后续选择氧化应激干预时间点提供了依据。3慢性脑缺血脑内SIRT1信号通路对大鼠认知功能及氧化应激的影响 健康雄性Wistar大鼠实验分组如下：（1）假手术6周组（2）慢性脑缺血6周组（3）白藜芦醇+慢性脑缺血6周组（4）白藜芦醇+EX-527+慢性脑缺血6周组（5）EX-527+慢性脑缺血6周组。白藜芦醇通过腹腔注射的方式进行给药，给药剂量为每天50mg/Kg。EX-527每天向侧脑室内注射5μg。于2-VO术后6周对各组大鼠利用Morris水迷宫进行学习记忆能力检测，实时定量PCR及Western blot检测SIRT1、FOXO3α、PGC-1α表达水平。按试剂盒说明书对脑组织匀浆进行SOD、MDA水平测定。 Morris水迷宫行为学试验结果显示，定位航行试验中慢性脑缺血大鼠在接受白藜芦醇治疗后，试验第2天、第3天和第5天逃避潜伏期明显缩短，空间探索试验中跨越原平台所在象限时间明显延长；慢性脑缺血大鼠接受SIRT1抑制剂EX-527治疗后定位航行试验第2至5天逃避潜伏期均明显延长，空间探索试验中跨越原平台所在象限时间明显缩短；同时给予白藜芦醇及EX-527治疗的大鼠，与单纯慢性脑缺血大鼠对比，试验第1天、第2天和第5天组逃避潜伏期变化不明显，第3天及第4天逃避潜伏期明显延长，空间探索试验中跨越原平台所在象限时间则明显缩短。实时定量PCR检测结果显示FOXO3α的mRNA水平在慢性脑缺血时降低，慢性脑缺血组与假手术组比较FOXO3α的mRNA水平差异显著。白藜芦醇干预后FOXO3α的mRNA水平升高，白藜芦醇+慢性脑缺血组与单纯慢性脑缺血组比较FOXO3α的mRNA水平差异显著。EX-527+慢性脑缺血组及白藜芦醇+EX-527+慢性脑缺血组大鼠FOXO3α的mRNA水平较单纯慢性脑缺血组明显下降，并明显低于白藜芦醇+慢性脑缺血组。SIRT1与PGC-1α的mRNA在各组之间的表达水平无明显差异。额叶及海马CA1区的免疫组化结果显示，SIRT1蛋白主要在细胞核内表达。假手术组可见一定程度的SIRT1蛋白阳性表达。2-VO术后额叶皮层和海马CA1区细胞排列分散，胞体变形。慢性脑缺血组SIRT1蛋白表达与假手术组对比明显减低，而白藜芦醇+慢性脑缺血组及白藜芦醇+EX-527+慢性脑缺血组SIRT1蛋白表达明显增强，EX-527+慢性脑缺血组与单纯慢性脑缺血组对比SIRT1的蛋白阳性表达无明显差异。磷酸化的FOXO3α（Ser253）蛋白主要在细胞核内表达。假手术组内FOXO3α蛋白在神经元细胞核内表达丰富，细胞浆表达罕见，慢性脑缺血组大鼠FOXO3α蛋白神经元内表达显著减少，细胞核及细胞浆内均有FOXO3α蛋白表达，以细胞核为著，变性的神经元无明显表达。白藜芦醇+慢性脑缺血组大鼠额叶皮层和海马CA1区内变性神经元及正常神经元均有FOXO3α蛋白表达，主要见于细胞核，较2-VO组大鼠表达显著增加。额叶皮层内EX-527+慢性脑缺血组及白藜芦醇+EX-527+慢性脑缺血组与单纯2-VO组对比FOXO3α表达变化不明显，但显著低于白藜芦醇+慢性脑缺血组。海马CA1区EX-527+慢性脑缺血组FOXO3α表达水平明显低于单纯慢性脑缺血组，白藜芦醇+EX-527+慢性脑缺血组与单纯慢性脑缺血组对比FOXO3α表达变化不明显，但显著低于白藜芦醇+慢性脑缺血组。假手术组PGC-1α蛋白表达丰富表达，细胞核和细胞浆均表达，细胞浆可见较多表达。慢性脑缺血组神经元数量减少，细胞肿胀明显，PGC-1α表达明显减少，细胞核及细胞浆均见表达，胞浆表达相对明显，部分在胞膜下表达。白藜芦醇干预后PGC-1α表达增加，主要出现在细胞核。EX-527+慢性脑缺血组及白藜芦醇+EX-527+慢性脑缺血组PGC-1α总体表达减少，主要见于胞浆表达，与白藜芦醇组比较差异显著。Western blot结果显示慢性脑缺血组SIRT1蛋白水平表达明显低于假手术组，白藜芦醇+慢性脑缺血组及白藜芦醇+EX-527+慢性脑缺血组SIRT1蛋白水平明显高于单纯慢性脑缺血组，EX-527+慢性脑缺血组SIRT1蛋白水平与单纯慢性脑缺血组对比无明显差异。磷酸化FOXO3α（Ser253）蛋白在慢性脑缺血组表达与假手术比较明显降低，白藜芦醇+慢性脑缺血组磷酸化FOXO3α（Ser253）的蛋白水平升高，与单纯慢性脑缺血组比较差异显著。EX-527+慢性脑缺血组及白藜芦醇+EX-527+慢性脑缺血组磷酸化FOXO3α（Ser253）的蛋白水平与单纯慢性脑缺血组比较下降不明显，但明显低于白藜芦醇+慢性脑缺血组。慢性脑缺血组PGC-1α蛋白水平明显低于假手术组。白藜芦醇+慢性脑缺血组PGC-1α蛋白水平明显高于单纯慢性脑缺血组，EX-527+慢性脑缺血组PGC-1α蛋白水平明显低于单纯慢性脑缺血组。白藜芦醇+EX-527+慢性脑缺血组PGC-1α蛋白水平明显低于单纯慢性脑缺血组。2-VO术后6周各组间氧化应激检测结果显示，慢性脑缺血组SOD水平降低，而MDA水平升高，与假手术组比较差异显著。与单纯慢性脑缺血组比较，白藜芦醇+慢性脑缺血组SOD水平升高，MDA水平降低，组间比较差异显著。与单纯慢性脑缺血组比较，EX-527+慢性脑缺血组SOD表达水平降低，MDA表达水平升高，组间比较差异显著。白藜芦醇+EX-527+慢性脑缺血组大鼠脑内MDA水平明显高于单纯慢性脑缺血组，SOD水平两组之间比较差异不显著。 以上结果提示在慢性脑缺血状态下，SIRT1以及其下游底物PGC-1α、FOXO3α表达受到抑制，SIRT1可以对FOXO3α从转录水平进行调节，而对PGC-1α的表达调节主要发生在蛋白水平。SIRT1-PGC-1α/FOXO3α信号通路影响慢性脑缺血大鼠的氧化应激反应，活性提高可以增强大鼠的抗氧化应激的能力，有效改善慢性脑缺血大鼠的认知损伤。白藜芦醇对慢性脑缺血大鼠认知损伤的改善作用，与增强SIRT1信号通路介导的抗氧化应激的能力有关，本研究为其用于血管性认知损伤的防治提供了实验室证据，有望成为血管性认知损伤新的治疗药物之一。