桑叶多糖分离纯化、结构分析及生物活性研究

桑(Moralba L.)为桑科(Moraceae )桑属(Morus)植物,广泛分布于热带、亚热带及温带地区,在我国南北各地均有广泛种植,因此桑叶资源丰富。桑叶是一种药食两用资源,我国作为中药使用由来已久,具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目等功效。早期国内外对桑叶的研究主要集中在生物碱、黄酮、多酚等活性成分,近年来桑叶中的主要活性成分多糖也引起了研究者的关注,但目前对桑叶多糖的研究仍有限。鉴于此,为桑叶多糖类保健食品或药物的开发利用奠定理论基础和提供技术支撑,本论文对桑叶多糖进行了较为系统的研究,包括桑叶多糖的提取优化及静态流变学特性研究、分离纯化、理化性质测定及结构表征、体外模拟消化特性、抗氧化活性及免疫调节活性等方面。主要结果如下:1.桑叶多糖提取工艺及流变学特性研究选择提取温度、提取时间、液料比及提取次数等4个因素分别进行单因素实验,考察不同因素在不同水平对桑叶多糖得率的影响,筛选出对多糖得率影响显著的三个因素(提取温度、提取时间及液料比)及其中心实验点。在此基础上,采用Box-Behnken实验设计法,进行3因素3水平响应面优化实验,通过Design-Experts 8.0.6软件对数据进行统计分析,得到桑叶多糖的最佳提取条件为:提取温度92 ℃、提取时间3.5 h、液料比34 mL/g、提取次数2次。在该条件下,桑叶多糖的得率为10.0 ±0.50%。研究浓度、温度、pH、蔗糖及NaCl对桑叶多糖溶液静态流变学性质的影响。结果表明:桑叶多糖的表观粘度随多糖浓度的增加而增加,表现为非牛顿型假塑性流体;低温能有效增加桑叶多糖的表观粘度;低pH环境显著降低桑叶多糖的表观粘度,在高pH环境中具有耐碱性;添加蔗糖具有增稠效果;添加低浓度NaCl,多糖粘度变化不明显,NaCl浓度继续增加,多糖粘度逐渐增大。2.桑叶多糖的分离纯化、理化性质及结构分析通过DEAE-纤维素阴离子交换柱层析法对桑叶粗多糖进行初步纯化,得到三个组分MLP-1、MLP-2及MLP-3,采用葡聚糖G-100凝胶过滤柱层析法对主要组分MLP-3进行进一步的纯化,得到桑叶多糖纯化组分MLP-3a及MLP-3b。采用分子排阻高效液相色谱法对MLP-3a及MLP-3b的纯度进行鉴定,结果表明MLP-3a及MLP-3b都是均一的多糖组分,平均分子量分别为80.99 KDa及3.64 KDa。采用苯酚硫酸法、考马斯亮蓝法、间羟联苯法、氯化钡-明胶法、福林酚法对粗多糖、MLP-3a和MLP-3b的理化性质进行了测定。结果表明,粗多糖、MLP-3a及MLP-3b的总糖含量分别为52.09%、89.74%及37.20%;蛋白质含量分别为2.16%、0.83%及0.22%;糖醛酸含量为32.45%、6.53%及65.29%;硫酸基含量分别为1.73%、1.40%及1.22%;多酚含量分别为 1.93、0.17、0.16 (mg GAE/100 mg )。采用高效液相色谱、红外光谱、紫外光谱、甲基化反应及核磁共振等对粗多糖、MLP-3a及MLP-3b进行结构分析。结果表明,粗多糖、MLP-3a及MLP-3b的单糖组成及摩尔比分别为:粗多糖(Man:Rha:GlcA:GalA:Glc:Gal:Ara = 0.51:5.13:2.23:3.02:2.13: 2.95: 2.55)、MLP-3a(Man: Rha: GlcA: GalA: Glc: Gal: Ara = 0.77:4.53: 0.81:1.21: 3.47: 12.55: 11.14)、 MLP-3b (Rha: GlcA: GalA: Gal: Ara= 1.57: 0.20: 6.10: 1.27:0.89)。MLP-3a 的主链由 α-1,3-Ara 及 β-1,4-Gal 构成,侧链为 1,3,5-Ara、1,3,6-Glc、1,2-Rha,1,4-GalA,GalA部分乙酰化,侧链末端为Glc及Ara。 MLP-3b的主链由α-1,4-GalA重复连接形成的光滑区和由α-1,4-GalA与α-1,2-Rha交替连接形成的毛发区构成,部分GalA发生甲酯化及乙酰化;Rha的C4位有分支,侧链包括β-1,4-Gal、α-1,5-Ara 以及 α-1,3-Ara,末端为 Gal 及 Ara。3.桑叶多糖体外模拟口腔及胃肠液消化采用体外唾液、模拟胃液及胃肠液消化实验研究桑叶粗多糖及其纯化组分MLP-3a及MLP-3b在口腔及胃肠液的消化情况。结果表明,桑叶粗多糖及其纯化组分经唾液消化后,其分子量均没有发生变化,无还原糖生成,也没有检测到游离单糖,说明桑叶多糖在口腔中不被消化;桑叶多糖及其纯化组分经模拟胃液及模拟胃肠液消化后,分子量无显著变化,还原糖含量无显著变化,没有检测到游离单糖的生成,表明桑叶多糖在胃液及胃肠液中均不被消化。4.桑叶多糖的抗氧化活性通过化学法(包括清除DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基、ABTS自由基,金属离子螯合力、还原力、铁离子还原力、抑制脂质过氧化、抑制β-胡萝卜素亚油酸氧化)及大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞PC12细胞模型法评价桑叶多糖的体外抗氧化活性。结果表明桑叶粗多糖及其纯化组分MLP-3a、MLP-3b具有较弱的还原力,中等的DPPH自由基清除能力,较强的清除羟基自由基、超氧阴离子自由基、ABTS自由基能力以及金属离子螯合能力,能有效抑制脂质过氧化、抑制β-胡萝卜素亚油酸氧化。桑叶粗多糖及MLP-3b组分能有效抑制H2O2诱导PC12细胞氧化损伤。5.桑叶多糖的免疫调节活性采用体外细胞模型评价桑叶多糖纯化组分MLP-3a的体外免疫活性。结果表明MLP-3a能有效促进小鼠腹腔巨噬细胞(RAW264.7)的增殖;提高RAW264.7吞噬中性红的能力及其酸性磷酸酶活性;还能有效提高RAW264.7 NO和细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-lβ的释放量,表明MLP-3a在体外具有较好的免疫促进作用。采用环磷酰胺诱导小鼠免疫抑制模型探讨MLP-3a的体内免疫活性。结果表明MLP-3a能有效提高免疫抑制小鼠的胸腺及脾脏指数,血清溶血素水平,脾脏溶菌酶含量,还能有效提高免疫抑制小鼠肝脏的CAT、T-AOC、T-SOD和GSH-Px的酶活,降低MDA的水平。