黄芪甲苷对帕金森病神经元的保护作用及其机制研究

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种以中脑黑质多巴胺能神经元（dopamine，DA）变性坏死为特征性病理变化的中枢神经系统退行性疾病，其主要临床表现为肌强直、静止性震颤、运动性迟缓及姿态障碍。帕金森疾病中黑质神经细胞死亡的原因尚不完全清楚，普遍认为与环境毒素、基因突变、遗传因素、氧化应激、免疫系统异常、铁离子聚集和神经兴奋毒性增强等诸多机制有关。随着人口老龄化的加剧和人们生活节奏的增快，以PD为代表的中枢神经退行性疾病已经成为仅次于心血管疾病、恶性肿瘤以及中风之后的主要致死性疾病，给患者以及全社会都造成十分严重的负担。因此，探寻神经系统退行性疾病的发病机制以及寻找最佳的疾病治疗策略已经成为当下神经科学研究领域的热点之一。 黄芪甲苷作为常用传统中药黄芪的特征性成分，已经被证明具有多种积极的药理学作用。研究表明，黄芪甲苷具有抗炎，抗氧化，抗凋亡等作用。我科以全军功能性脑疾病研究所为平台，致力于帕金森病的基础与临床研究，并于2006年开始对黄芪甲苷的药理作用进行研究，已经证实其对大脑缺血再灌注造成血脑屏障的损伤具有保护作用，并发挥抗炎作用。新近的研究表明，黄芪甲苷能促进中枢神经细胞的分化和轴突生长，并能对抗神经毒素引起的氧化损伤。 那么，黄芪甲苷对帕金森病中脑神经元是否具有保护作用？如果有，其保护程度如何，具体的分子机制是什么？本课题基于这些问题进行了研究。 本实验采用腹腔注射MPTP，用C57BL小鼠制备PD模型、MPP+诱导SH-SY5Y细胞，制备帕金森体外模型。将二者作为研究对象，分别给予黄芪甲苷进行处理；通过应用牵引实验和旷场实验检测PD小鼠的行为学的改变；应用免疫组织化学、Western blot等技术检测黄芪甲苷对PD模型的神经保护作用及其机制。 1.首先成功制备了MPTP诱导的小鼠PD模型，并观察到黄芪甲苷改善了MPTP对小鼠造成的行为学损害症状。在牵引实验中，对照组小鼠都能用四肢抓住电线，而模型组小鼠后爪运动功能受到损害，仅能用前爪抓电线；黄芪甲苷治疗组小鼠能用一只或两只后爪抓电线，其评分明显高于模型组；且高剂量组较低剂量组评分有所增高。在旷场实验中，MPTP使模型组小鼠的运动频率和站立次数显著降低，黄芪甲苷治疗组小鼠与模型组小鼠相比，其运动频率和站立次数显著增加。对中脑黑质致密部进行免疫组织化学染色发现，MPTP模型组黑质多巴胺神经元明显减少，而黄芪甲苷低剂量组和黄芪甲苷高剂量组的多巴胺神经元分别较模型组有所增加。进一步通过Western blot分析了黑质致密部细胞TH的表达量，发现治疗组较MPTP模型组TH表达量有所升高。 2.以MPP+诱导SH-SY5Y细胞制备的帕金森体外模型为研究对象，进一步验证黄芪甲苷对神经元的保护作用。实验结果显示，0-6mM的MPP+处理SH-SY5Y细胞，细胞活性随剂量增高而降低。3mM MPP+处理细胞24h，细胞活性被抑制50%。1-50μM的黄芪甲苷对SH-SY5Y细胞没有明显的毒性作用。使用25μM或50μM黄芪甲苷对细胞预处理2h，能明显降低MPP+诱导细胞损伤，细胞活性显著增高。进一步利用Hoechst33258进行染色，结果表明，MPP+处理后，SH-SY5Y细胞的细胞核出现明显的核固缩，使用黄芪甲苷明显降低了MPP+对细胞的损伤，核形态有所恢复。 3.对黄芪甲苷的神经保护作用机制进行研究，通过动物组织Westernblot分析，黄芪甲苷治疗组能明显抑制MPTP诱导的凋亡前体蛋白Bax表达量的升高，增加Bcl-2的表达量，并能抑制其下游凋亡蛋白caspase-3的表达。进一步在细胞模型中进行分析，黄芪甲苷治疗组同样能够明显抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞中Bax的表达，同时增加Bcl-2的表达量，并抑制了MPP+引起的caspase-3的活化。为了进一步验证黄芪甲苷保护由MPP+诱导的SH-SY5Y细胞的凋亡是通过BAX途径，我们设计了BAX siRNA，干涉了内源性的BAX的表达。实验结果证明，黄芪甲苷确实是通过BAX途径发挥了神经保护作用。此外为了全面研究黄芪甲苷的神经保护作用机制，我们还测定了细胞ROS的活性。结果表明，黄芪甲苷对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞过多产生的ROS具有明显抑制作用。 总而言之，本次实验综合运用了形态学、免疫学、分子生物学等多种研究方法，在国际上首次证实了黄芪甲苷对帕金森疾病神经元的保护作用，并且对其发挥作用的分子机制进行了初步探讨，为进一步研究黄芪甲苷在神经系统的保护作用及其临床应用奠定了基础。