研究背景银屑病(Psoriasis)是一种反复发作、缠绵难愈的常见临床疾病,流行病学研究发现,其累及全球约2%的人口,我国银屑病的发病率也很高,并且发病人数在不断增长[1.2]。银屑病最初的病理学改变是角质形成细胞异常增生、角化过度、不全,并伴有多种炎症相关细胞的浸润、聚集。由于其发病机制尚不明确,目前尚无完全根治的方法。现阶段普遍认为此病发生与免疫紊乱存在密切关系,多为体内及皮损处炎性细胞因子水平异常,多种免疫细胞的过度活化,以上几种途径相互作用最终引发炎性瀑布,致使皮损部位的炎性反应逐级放大,导致此病发生。干细胞(stem Cell,SC),是一类多潜能细胞,具有自我分化及更新能力,包括胚胎干细胞(embryonic stem celsl,ESCs)和成体干细胞(adult stem cells,ASCs)两类。而前者又可分为造血干细胞(hematopoietic stem celsl,HSCs)、间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)等,其中由于MSCs具有特殊的免疫调节功能和低免疫原性,临床上被广泛应用于多种与自身免疫紊乱相关的疾病的治疗中。此外,MSCs还可以通过分泌众多与炎症相关细胞因子对T淋巴细胞产生免疫调控作用,并通过其免疫调控作用帮助机体恢复免疫平衡。角质形成细胞(keratinocyte,KC)是免疫相关细胞,在银屑病发生发展中扮演重要角色。银屑病发生的最初病理学改变是KC的异常增殖并伴有角化不全、过度,血管内皮细胞大量增生及多种炎症相关细胞的浸润。此外银屑病的发生与角质形成细胞凋亡失控有关,由此可见角质形成细胞在银屑病发生发展过程中亦具有非常重要的作用。中医中药在银屑病的治疗中有着独特优势和不错的临床疗效,目前对此病的治疗多遵循朱仁康朱老的治疗观点即将其证形归为“血热”、“血瘀”、“血燥”三类并对应以“凉血”“活血”“养血”的治疗方法。宋坪主任医师在继承多位名老专家学术思想并结合临床经验的同时提出,“玄府闭郁,肾精亏损”这一银屑病发生的另一个重要病机,并对应以“开通玄府、补肾培元”方法治疗,在临床上取得良好治疗疗效。此外不同的医家学派对于银屑病的认识及治疗尚有不同思路及方法,研究中药有效组分对MSCs、KC及其炎性反应模型的免疫调控作用,从而将传统中医中药与免疫学进行结合,探索中药治疗银屑病可能存在的机制,将间充质干细胞、角质形成细胞、银屑病发病机制结合起来,从而丰富银屑病中医治疗的内涵。因此,本课题在传承导师“开玄补肾”法治疗银屑病的理论和临床实践经验上结合当代医家对银屑病病机认识,总结其常用药物并进行归类等前期工作的基础上,提出探索不同中药有效组分对MSCs、KC及两者炎性反应模型的免疫调控作用,从MSCs、KC这两种与银屑病发病相关的重要细胞入手,从中西医结合角度初步研究中药有效组分对银屑病相关炎性反应模型的免疫调控作用,从而初步研究中药有效组分治疗银屑病可能存在的机制。本研究采用酶标仪检测细胞增殖技术、流式细胞术、RT-qPCR、ELISA等技术,研究中药有效组分对MSCs和KC的细胞增殖、细胞周期的影响,及对炎性反应模型中炎症相关细胞因子分泌及基因表达情况的影响,进一步研究这些中药有效组分对MSCs、KC炎性反应模型的免疫调控作用,从而初步探索不同中药有效组分治疗银屑病可能存在的机制。综上,本项目基于以往资料和团队前期实验研究,分别探索中药有效组分对间充质干细胞、角质形成细胞及间充质干细胞、角质形成细胞炎性反应模型的免疫调控功能,融合临床研究及细胞学研究,探索中医有效治法治疗银屑病的可能存在免疫机制,丰富银屑病治疗内涵。研究目的1.明确射干苷、桃叶珊瑚苷对健康人来源的脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cells,AMSCs)及其分别用LPS、Poly I:C诱导后炎性反应模型的生物学作用。2.探讨黄芪甲苷、巴戟天多糖、丹皮酚对KC及用IL-22诱导后炎性反应模型的生物学作用。研究方法1.体外培养AMSCs和KC,分别培养至第3代、第12代备用,选用临床上常用中药的有效组分作用于正常AMSCs和KC,运用CCK-8实验、流式细胞术对AMSCs和KC进行细胞增殖研究和周期鉴定,筛选出相应的药物浓度。2.利用RT-qPCR和ELISA法检验炎性反应模型中相关炎性因子及其mRNA的表达量,建立炎性反应模型。3.并将筛选出的中药有效组分作用于炎性反应模型,运用CCK-8实验,ELISA、RT-qPCR实验方法探讨中药有效组分对AMSCs、KC炎性反应模型细胞增殖影响、相关炎性因子及mRNA的表达量的影响,研究中药有效组分对炎性反应模型的生物学作用。研究结果论文的第一部分,我们发现本次试验所选中药有效组分除桃叶珊瑚苷(25ug/mL)、苍术素(20ug/mL)之外,其他中药有效组分均能促进正常AMSCs的增殖(P<0.01或P<0.001)。白术内酯1、人参皂苷Rb1、射干苷、氧化苦参碱均能提高正常AMSCs的Gi期比例而降低G2期或S期比例(P<0.05或P<0.01);丹皮酚、黄芪甲苷能够降低健康AMSCs的Gi和S期比例而提高G2期比例(P<0.01或P<0.05)。使用LPS(20ng/uL)可促使炎性反应模型中IL-6、IL-8的分泌水平及mRNA表达量增加,从而建立AMSCs炎性反应模型;使用Poly I:C(25ug/mL)可促使AMSCs炎性反应模型中IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β的mRNA表达量增多,从而建立炎性反应模型。中药有效组分桃叶珊瑚苷、射干苷明显促进LPS诱导后炎性反应模型中AMSCs增殖(P<0.05或P<0.001);射干苷、桃叶珊瑚苷促进Poly I C诱导后炎性反应模型中AMSCs增殖(P<0.05)。射干苷(50μg/mL)、桃叶珊瑚昔(100μg/mL)可明显降低LPS诱导后AMSCs炎性反应模型中IL-8和IL-1β的分泌水平(P<0.05或P<0.01);同时两者均能降低LPS诱导后AMSCs炎性反应模型中IL-6、IFN-γ mRNA的表达量(P<0.05或P<0.01),且射干苷能降低TNF-amRNA的表达量(P<0.01),同时两者均有增加TGF-βmRNA表达量的趋势。射干苷(50μg/mL)、桃叶珊瑚苷(100μg/mL)均能降低Poly I:C诱导后AMSCs炎性反应模型中IL-8的分泌水平(P<0.001 或P<0.01)。论文第二部分我们发现巴戟天多糖(25ug/mL)、丹皮酚(1Oμg/mL)、黄芪甲苷(20ug/mL)抑制正常KC增殖(P<0.001)。使用IL-22(50ng/mL)可促使KC炎性反应模型中IL-6、IL-8分泌水平及mRNA表达量增多(P<0.01),从而建立KC炎性反应模型。而以上中药有效组分则增加了炎症反应模型中IL-6、IL-8、IL-17、IL-1βmRNA的表达量。研究结论1、LPS可诱导健康AMSCs向促炎方向转变而中药有效组分桃叶珊瑚苷、射干苷能降低炎性反应模型IL-1β、IL-8的分泌量及IL-6、TNF-α、IFN-γ mRNA的表达量而缓解炎症。2、poly I:C可诱导健康AMSCs向促炎、抑炎双向转变,而中药有效组分桃叶珊瑚苷、射干苷能降低炎性反应模型中IL-8的分泌水平而在一定程度上缓解炎症。3、中药有效组分黄芪甲苷20ug/mL、丹皮酚10ug/mL、巴戟天多糖25ug/mL白术内酯1 25ug/mL、白术内酯3 25ug/mL能够正常抑制角质形成细胞增殖。
