基于分子对接策略的熟地黄防治糖尿病性骨质疏松症有效成分及其作用机制研究

糖尿病性骨质疏松症(diabetic osteoporosis,DOP)是糖尿病并发单位体积内骨量减少,骨组织微结构改变,骨强度减低、脆性增加等易发生骨折的一种全身性、代谢性骨骼疾病,是糖尿病在骨骼系统的重要并发症之一。糖尿病是一种由胰岛素分泌缺陷或胰岛素功能障碍引起的以高血糖为特征的代谢疾病。持续的高血糖和长期的代谢紊乱引起各器官的损伤,特别是对于眼睛、肾、心血管和神经系统,是导致DOP的原因。作为糖尿病患者的主要骨并发症,由于其发病隐形、发病率和致残风险高的特征,已越来越受到人们的关注。熟地黄是玄参科多年生植物地黄(Rehmannia glutinosa Libosch)的干燥块根,具有滋阴补血、益精填髓的功效,作为传统中药已有两千多年的历史。大量临床和药理实验表明熟地黄可抗肿瘤、抗应激、抗凝血、降低血糖、减少骨丢失,提示具有防治DOP潜力。本课题以熟地黄作为研究对象,应用高糖高脂饲料结合链脲佐菌素诱导的糖尿病性骨质疏松大鼠模型明确了熟地黄抗DOP作用;利用分子对接技术预测熟地黄抗DOP的活性成分及作用靶点;采用高糖诱导的成骨细胞损伤模型,根据分子对接结果研究活性成分对高糖损伤成骨细胞的作用机制。本课题研究了熟地黄防治糖尿病性骨质疏松大鼠的作用,明确了熟地黄中抗DOP的活性成分及其作用机制。据此开展了以下方面研究工作:一、熟地黄抗DOP药效研究采用高糖高脂饲料联合小剂量链脲佐菌素注射诱导糖尿病性骨质疏松模型,对熟地黄抗DOP作用进行了药效学研究,观察了熟地黄水提液对糖尿病性骨质疏松大鼠血糖、血清和尿液生化指标,骨组织形态和计量参数的影响。结果显示,与空白组相比,模型组大鼠血糖显著升高,ROI区域骨质较为疏松,骨小梁数目显著减少,且骨小梁间隙显著增大,造模成功。模型组大鼠的骨形成指标碱性磷酸酶活性、骨钙素水平和骨吸收指标抗酒石酸酸性磷酸酶活性和DPD含量均显著升高,提示糖尿病性骨质疏松可能是高转换型骨质疏松症。熟地黄及熟地黄与二甲双胍连用显著提高血清中碱性磷酸酶活性,显著降低了血清骨钙素和尿液DPD含量,但对血液中抗酒石酸酸性磷酸酶含量无显著影响。此外,阳性药二甲双胍组、熟地黄组及熟地黄联合二甲双胍用药组可显著增加模型大鼠股骨骨密度、骨组织矿含量、骨体积分数,同时显著减少骨小梁分离度,表明熟地黄可促进骨形成,抑制骨吸收,具有抗糖尿病性骨质疏松作用,熟地黄联合二甲双胍用药效果更为明显。二、基于分子对接策略筛选熟地黄防治DOP的活性成分和作用靶点构建糖尿病性骨质疏松关键靶蛋白库(BMP2、Carbonic anhydrases II、Cathepsin K、β-catenin、ERK5、GSK-3β、IGF-1R、JNK、PPAR-γ)和熟地黄化学成分库,利用分子对接技术将熟地黄化学成分与DOP关键靶蛋白进行对接分析,结果显示共有44个成分与9个蛋白对接成功,其中环烯醚萜苷类(18个)和苯乙醇苷类成分(11个)能量值较低,具有较好的结合活性,而在这9个蛋白中与熟地黄成分结合较好的为GSK-3β、IGF-1R及PPAR-γ。利用western blot法对环烯醚萜类成分中的梓醇、苯乙醇苷类中的毛蕊花糖苷和松果菊苷与GSK-3β、IGF-1R、PPAR-γ的结合进行验证,Western blot结果显示熟地黄活性成分给药4h后,梓醇给药组、毛蕊花糖苷给药组和松果菊苷给药组中成骨细胞的IGF-1R表达量升高,PPAR-γ和GSK-3β表达减少。三、熟地黄活性成分对高糖损伤成骨细胞的作用机制探讨采用高糖诱导MC3T3-E1成骨细胞损伤模型考察了熟地黄中环烯醚萜苷类和苯乙醇苷类共6个成分的体外抗糖尿病性骨质疏松及机制研究。结果显示熟地黄环烯醚萜苷类成分梓醇和苯乙醇苷类成分毛蕊花糖苷能够增加BMP2、RUNX2和Osteriex的表达,进而增加成骨细胞碱性磷酸酶的活性和骨基质的矿化。同时能够刺激成骨细胞胰岛素样生长因子的产生,增加胰岛素样生长因子-1受体的表达,增加PI3K的磷酸化和m TOR的表达,最终促进成骨细胞的形成和分化。熟地黄环烯醚萜苷类成分梓醇和苯乙醇苷类成分毛蕊花糖苷还可抑制GSK3?的表达,增加?-catenin的积累,使得?-catenin进入细胞核,激活靶基因的转录,调控成骨细胞的增殖和分化。说明熟地黄活性成分通过调节BMP和IGF/IGF-1R信号通路及促进?-catenin的积累,增加成骨细胞的增殖和分化。