半夏凝集素的表达、纯化及抗菌性质研究

凝集素是一种广泛存在于动植物及微生物体中的选择性结合或非共价性结合于糖基的蛋白或糖蛋白。这类蛋白的主要性质是它们可以特异性的与糖类物质作用,而且与细胞表面的糖类复合物相结合。 根据目前的生物化学、分子生物学和结构分析学的研究进展,从进化和结构相关性来分,凝集素可分成7个不同家族:葫芦科韧皮部凝集素;觅科凝集素;包含Hevein结构域的壳多糖结合蛋白;木菠罗素(jacaLin)家族;豆科凝集素;单子植物甘露糖结合凝集素;2型核糖体失活蛋白(RIP)。半夏属于天南星科,天南星科凝集素属于单子植物甘露糖结合凝集素,可以特异性的与甘露低聚糖结合。它们可以快速凝结兔血细胞,但是不能凝结人血细胞。 为了研究半夏凝集素及其亚基的性质,本研究分别构建了含半夏凝集素表达前体蛋白PTA-P、两个亚基蛋白PTA-DOM1及PTA-DOM2的原核表达载体,并成功地实现了这三个基因在E.coLi BL21中的表达了含有N端组氨酸标签的融合蛋白。表达的蛋白在镍氢离子柱上纯化并成功复性。 本研究发现融合蛋白PTA-P、PTA-DOM1和PTA-DOM2主要有以下特性:1.可以凝集兔血,但是不能凝集人血而且他们的凝血活性受到甘露糖的抑制。这些性质和天南星科其他的凝集素是相似的。2.这三种半夏凝集素蛋白对细交链孢、离蠕孢、新月弯孢的生长具有明显的抑制,而且PTA-P的抑菌活性要高于其他两种蛋白。在被测试的三种真菌中,PTA-P、PTA-DOM1和PTA-DOM2均对细交链孢显示了最高的敏感性,对新月弯孢的敏感性最低。用50μg蛋白处理真菌24小时后,发现真菌菌丝尖端发生肿大而且多生分枝。3.三种半夏凝聚素蛋白在20℃和60℃之间保持完整活性,当温度达到100℃时只保留25%的活性。4.三种半夏凝集素蛋白在pH4到pH9之间都显示了活性,在pH7.8是活性最高。研究发现三种半夏凝集素蛋白还可以抑制细菌的生长,暗示利用分子生物学手段将PTA－P及两个亚基基因导入植物使之产生抗病性可能将是一个可行的方案。