淫羊藿苷对成骨细胞增殖分化的影响及机制探讨

颌骨缺损的修复在口腔医学领域是一个前沿课题，祖国医学运用中药促进新骨的形成有着悠久历史，以“肾补骨”理论为指导的对补肾中药的成骨作用机制研究更是成为了一个研究热点。淫羊藿是中国传统的补肾壮骨中药，具有补肾助阳、强筋健骨之功效。淫羊藿苷(Icariin, ICA)为淫羊藿的主要活性成分，目前有关淫羊藿苷对成骨细胞的增殖、分化等方面的研究虽然较多，但是研究结论不一，淫羊藿苷的机制研究不够深入，其具体作用靶点、作用信号通路的具体环节和途径等细胞内信号系统的作用机制尚不清楚。骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins, BMPs)是骨修复中最主要的成骨诱导因子，BMPs与其受体BMPR结合通过Smads和p38MAPK等途径进行信号转导并通过下游转录因子Runx2、Osterix等与相应的成骨细胞特异蛋白碱性磷酸酶、骨钙素等基因启动子连接促进细胞向成骨方向分化。本研究从以下四个方面研究淫羊藿苷对成骨细胞增殖分化的影响及成骨机制，以阐明该药物作用的分子机制。一是淫羊藿苷对成骨细胞增殖活性的影响，二是淫羊藿苷对成骨细胞分化的影响，三是淫羊藿苷对BMP2-Smads-Runx2信号通路的影响，四是淫羊藿苷对BMP2-p38MAPK通路的影响。本研究为今后的实验提供科研思路和方法，为临床应用淫羊藿苷促进成骨功能，提供深入的理论依据。 第一部分淫羊藿苷对成骨细胞形态及增殖活性的影响 目的：本部分实验通过对MC3T3-E1细胞形态观察，MTT法检测不同浓度ICA在不同时间对MC3T3-E1细胞增殖活性的影响以及应用Real-Time PCR、Western blot方法检测ICA对MC3T3-E1细胞增殖标志基因PCNA和Ki67表达的变化，系统研究ICA在体外对成骨细胞增殖的影响。 方法：体外培养小鼠颅顶前成骨细胞MC3T3-E1，不同浓度（0、0.01、0.1、1μM）的ICA分别孵育MC3T3-E1细胞24h、48h、72h，用MTT法检测不同浓度的ICA在不同时间对MC3T3-E1细胞增殖活性的影响。应用Real-Time PCR法检测增殖标志基因PCNA和Ki67的mRNA表达；Western blot法检测增殖标志基因PCNA和Ki67蛋白的表达。 结果：细胞形态学观察，不同浓度的ICA对MC3T3-E1细胞的形态无明显影响；0、0.01、0.1、1μM各浓度组的ICA对成骨细胞的增殖无明显的影响，随着培养时间的延长，细胞增殖能力有所增加但和对照组相比无统计学差异。不同浓度的ICA对MC3T3-E1细胞的增殖标志基因PCNA和Ki67的mRNA和蛋白表达均无明显的影响。 结论：ICA对MC3T3-E1细胞的形态无明显影响；对MC3T3-E1细胞的增殖活性无明显的影响，ICA可能是通过对MC3T3-E1细胞分化等其他生物学特征产生影响而发挥作用。 第二部分淫羊藿苷对成骨细胞分化的影响 目的：本部分实验应用透射电镜观察ICA对MC3T3-E1细胞超微结构的影响以及通过检测不同浓度的ICA在不同时间对MC3T3-E1细胞ALP活性的影响，ICA对BMP2以及成骨细胞分化过程中相关基因BGP、OPN、COL1的表达变化，研究ICA对MC3T3-E1细胞分化的影响。 方法：体外培养小鼠颅顶前成骨细胞MC3T3-E1，1μM ICA作用MC3T3-E1细胞14d,应用透射电镜观察ICA对MC3T3-E1细胞超微结构的影响。并应用不同浓度（0、0.01、0.1、1μM）的ICA孵育MC3T3-E1细胞，用磷酸苯二钠法检测不同浓度的ICA在不同时间（24h、48h、72h）对MC3T3-E1细胞ALP活性的影响；应用Real-Time PCR法检测BGP、OPN、COL1、BMP2mRNA的表达；Western blot方法检测ICA对BGP、OPN、COL1、BMP2蛋白表达的影响。 结果：扫描电镜下观察MC3T3-E1细胞，细胞表面突起少，细胞质内高尔基体、内质网和线粒体等细胞器不发达，呈前成骨细胞样表型。ICA作用MC3T3-E1细胞14天后，扫描电镜下观察此时的细胞，发现细胞表面突起较多，细胞核位于细胞的一侧，核仁较明显，胞浆中散在丰富的糖元、溶酶体及呈同心圆状排列的髓样化结构，细胞核周围有较多的高尔基体、扩张的粗面内质网和散在的椭圆形线粒体，MC3T3-E1细胞经ICA作用后，呈成骨细胞样表型。经过0.01、0.1和1μM ICA作用后，与0μMICA对照组相比，MC3T3-E1细胞ALP活性显著增加，其中1μM药物组作用效果最明显；并且随着作用时间的延长，药物作用效果显示出显著的时间依赖效应。与0μM ICA对照组相比，0.01、0.1和1μM ICA作用MC3T3-E1细胞48h后，BMP2的mRNA和蛋白水平呈浓度依赖性上调（P<0.05），其中以1μM ICA的刺激作用最强，可以显著地增加BMP2的mRNA和蛋白表达水平。 经过0.01、0.1和1μM ICA作用48h后，MC3T3-E1细胞中BGP、OPN、COL1转录及翻译水平均显著增加（P<0.05）。 结论： 1. MC3T3-E1细胞经ICA作用后，其超微结构呈成骨细胞样表型。 2. ICA在0～1μM浓度范围内，可以时间-剂量依赖性增加MC3T3-E1细胞中ALP活性； 3. ICA上调成骨细胞分化的关键基因BGP、OPN、COL1，这些分子表达水平改变以后，会以不同方式直接或间接影响成骨细胞的微环境，促进骨分化和骨形成。 4. ICA上调成骨诱导因子BMP2的表达，可诱导成骨细胞的分化。 第三部分BMP2-Smads-RunX2信号通路在淫羊藿苷诱导成骨细胞分化中的作用 目的：本部分实验应用Real-Time PCR、Western blot方法，观察ICA对BMP2、Smad1、Smad5、Smad8、RunX2、Osterix表达的影响，从BMP2-Smad-RunX2信号通路入手，研究ICA成骨机制 方法:1μM的ICA孵育MC3T3-E1细胞48h，Real-Time PCR、Westernblot方法检测BMP2、Smad1、Smad5、Smad8、RunX2、Osterix的表达；应用RunX2的特异性小干扰RNA沉默RunX2的表达，观察RunX2在MC3T3-E1细胞分化中的作用。 结果：与0μM ICA对照组相比，1μM ICA作用MC3T3-E1细胞48h后，BMP2、Smad1、Smad5、Smad8、RunX2和Osterix的mRNA和蛋白表达水平均不同程度增高。 RunX2-siRNA对MC3T3-E1细胞中RunX2的mRNA和蛋白表达量均降低；其中40nM RunX2-siRNA转染后可高效抑制RunX2的mRNA和蛋白表达；转染40nM RunX2-siRNA的MC3T3-E1细胞中ALP活力显著下降；40nM RunX2-siRNA下调MC3T3-E1细胞分化相关基因BGP、COL1、OPN的mRNA和蛋白表达。 结论： 1.BMP2参与了ICA诱导MC3T3-EI细胞的成骨分化过程。 2.ICA可能是通过BMP2-Smads-RunX2-Osterix通路促进成骨细胞分化。 3.RunX2基因在MC3T3-E1细胞分化过程中，发挥着中枢样的调控作用，直接影响下游ALP活性及细胞分化相关基因BGP、COL1、OPN分子的转录和翻译。 第四部分BMP2-p38MAPK信号通路在淫羊藿苷诱导成骨细胞分化中的作用 目的：本部分实验应用Western blot方法检测ICA对p38MAPK、ERK、JNK表达及其磷酸化水平变化的影响并应用p38MAPK的特异性抑制剂SB203580阻断其作用，从BMP2-p38MAPK信号通路，研究ICA成骨机制。 方法:1μM的ICA孵育MC3T3-E1细胞48h，Western blot方法检测p38MAPK、ERK、JNK表达及其磷酸化水平的变化；应用p38MAPK的特异性抑制剂SB203580阻断其作用，观察ICA对MC3T3-E1细胞分化的影响。 结果：与0μM ICA对照组相比，1μM ICA作用MC3T3-E1细胞48h后，p38MAPK、ERK、JNK表达无显著性差异；细胞中p-p38MAPK的水平显著增加（P<0.05），而p-ERK和p-JNK的水平不受影响（P>0.05）。表明ICA可磷酸化p38MAPK，对ERK、JNK无磷酸化作用。 与1μM ICA作用MC3T3-E1细胞的单独作用相比，p38MAPK抑制剂SB203580阻断p38MAPK活化，再给予1μM ICA作用MC3T3-E1细胞48h后，p-p38MAPK的水平明显下降（P<0.05）。表明p38MAPK抑制剂SB203580能够抑制ICA对p38MAPK的磷酸化作用。 与1μM ICA作用MC3T3-E1细胞的单独作用相比，p38MAPK抑制剂SB203580阻断p38MAPK活化后，再给予1μM ICA作用MC3T3-E1细胞48h，细胞中ALP活性明显下降（P<0.05） 与1μM ICA作用MC3T3-E1细胞单独作用相比，p38MAPK抑制剂SB203580阻断p38MAPK活化后，再给予1μM ICA作用MC3T3-E1细胞48h，细胞中BGP、COL1和OPN的mRNA和蛋白表达则明显下降（P<0.05）。 结论：ICA可磷酸化p38MAPK，对ERK、JNK无磷酸化作用，ICA可能是通过BMP2-p38MAPK信号通路促进成骨细胞分化。