复方肠泰诱导结肠癌细胞自噬活化巨噬细胞的研究

目的：通过观察复方肠泰诱导小鼠结肠癌CT26.WT细胞分泌的自噬体对巨噬细胞RAW264.7活化的影响,探讨复方肠泰诱导肿瘤细胞的自噬与抗肿瘤免疫之间的内在关系,从肿瘤免疫学原理来阐明复方肠泰的抗肿瘤作用机制,为中药在抗肿瘤免疫的作用提供实验依据和理论基础。方法：1、复方肠泰诱导小鼠结肠癌CT26.WT细胞自噬的研究利用MTT比色法观察不同浓度复方肠泰对CT26.WT细胞增殖的影响,明确最适给药浓度；Western Blot检测不同浓度复方肠泰作用于CT26.WT细胞后自噬标志蛋白LC3的表达；采用脂质体转染法构建eGFP-LC3 CT26.WT细胞株,复方肠泰干预后荧光显微镜下观察自噬标志蛋白LC3的表达及分布。2、复方肠泰诱导小鼠结肠癌CT26.WT细胞分泌的自噬体的提取与鉴定显微镜观察复方肠泰处理CT26.WT细胞48h后细胞形态的变化,利用专利技术提取囊泡类物质,通过透射电镜观察细胞的超微结构变化、电镜及Western Blot检测自噬标志蛋白LC3的表达以鉴定所提物质是否为自噬体。3、小鼠巨噬细胞RAW264.7对诱导分泌的自噬体的识别与摄取以CFSE标记所提取的自噬体,将其加入RAW264.7细胞(6 μg/ml终浓度)培养48h,流式细胞术和激光共聚焦观察巨噬细胞RAW264.7对自噬体的识别和摄取。4、诱导分泌的自噬体活化小鼠巨噬细胞RAW264.7的研究将提取的自噬体作用于巨噬细胞RAW264.7 (6 μg/ml终浓度),流式细胞术检测自噬体对RAW264.7细胞膜表面共刺激分子CD80、CD40的表达；ELISA检测自噬体刺激巨噬细胞培养上清中的细胞因子TNF-a和IL-6分泌量；qPCR检测巨噬细胞活化的相关细胞因子TNF-α、IL-6、MCP-1、IL-1β的mRNA的转录水平。结果：1、MTT结果显示低浓度复方肠泰作用结肠癌CT26.WT细胞48h,细胞活性无显著变化,无明显的细胞毒性作用,高浓度复方肠泰对CT26.WT细胞有明显的抑制作用,呈剂量依赖性。复方肠泰处理转染了绿色荧光蛋白(EGFP)融合了自噬标记蛋白LC3的CT26.WT细胞后,阴性对照组中可见绿色荧光均匀分布于细胞胞浆内,而加入不同浓度的复方肠泰处理后可见胞浆内出现绿色荧光点,代表着自噬体的形成增多。Western Blot检测结果显示自噬标记蛋白LC3II的表达随着复方肠泰浓度的增加而表达量升高,阳性对照雷帕霉素组亦出现同样现象,表明复方肠泰作用于CT26.WT细胞后可诱导其发生自噬,并形成自噬体。2、显微镜下观察复方肠泰处理CT26.WT细胞48h后形态出现显著变化,细胞内出现大量囊泡样颗粒,随着浓度的增加,囊泡逐渐增多增大。透射电镜进一步证实复方肠泰干预结肠癌CT26.WT细胞后有大量具有双层膜结构的自噬泡形成。利用专利技术提取细胞内的囊泡样物质后,经电镜观察其结构、大小、Western Blot鉴定结果显示所提取的囊泡类物质中含有大量LC3 II,证实其为肿瘤细胞分泌的自噬体。3、以CFSE标记所提取的自噬体刺激RAW264.7细胞48h后,流式细胞术和激光共聚焦观察结果显示自噬体能够被巨噬细胞有效的识别并摄取。4、将所提取的自噬体作用RAW264.7细胞48h之后,可显著上调巨噬细胞表面的共刺激分子CD80及CD40的表达,增加巨噬细胞培养基上清中的TNF-α、IL-6细胞因子的分泌量,升高巨噬细胞活化的相关细胞因子TNF-α、IL-6、MCP-1、IL-1β的mRNA的转录水平。结论：复方肠泰作用于结肠癌CT26.WT细胞后可诱导肿瘤细胞发生自噬,分泌的自噬体能够被巨噬细胞有效识别并摄取,自噬体作用于巨噬细胞后可显著上调其表面的共刺激分子CD80及CD40的表达,增加培养上清中细胞因子TNF-α、IL-6的分泌量,且提高巨噬细胞活化的相关细胞因子TNF-α、IL-6、MCP-1、IL-1β的mRNA的转录水平,表明复方肠泰诱导结肠癌细胞产生的自噬体可激活巨噬细胞,并诱导其向抗肿瘤亚型-M1型活化,增强其杀伤肿瘤的能力。综合以上结果,复方肠泰对结肠癌的抗肿瘤作用与其诱导肿瘤细胞自噬分泌的自噬体活化巨噬细胞,促进抗肿瘤免疫应答相关。