基于TR3核受体靶点川芎中抗肿瘤苯酞类成分的分离与鉴定

肿瘤是影响人类生命健康的重要危险因素,在我国,恶性肿瘤已成为我国居民死亡原因的主要因素。随着我国人口老龄化趋势逐渐上升和不良生活方式的广泛存在,癌症的发生率和死亡率将会逐渐增加。因此,癌症已成为人类亟需解决的一个难题。近年来,靶向治疗由于在某些癌症上的治疗得到了明显的效果而备受关注。TR3线粒体凋亡通路的发现使得TR3成为一个筛选靶向治疗癌症分子药物的靶点。我们在前期研究中发现苯酞类化合物具有靶向调控TR3抑制肿瘤生长的作用。本论文在前期研究的基础上,结合生物活性筛选模型的指导,有针对性地从中国传统中药川芎中分离苯酞类化合物,旨在遴选出具有靶向调控TR3活性、抗癌作用更加特异高效的活性先导化合物,并进一步通过生物学手段阐述其作用机制。本研究首先通过超声波溶剂提取法、溶剂回流提取法、溶剂萃取法从川芎中提取和富集苯酞类化合物,利用C18反相柱色谱法粗分离为10个组分,对这些组分进行活性测试筛选出活性较好的Z0-6和Z0-7组分。利用中压制备和高效液相制备等方法从川芎的活性组分中初步分离得到15个化合物。经核磁、质谱等波谱学分析鉴定其中的12个化合物,其化学名称分别为:Butylphthalide(1)、Z-ligustilide(2)、Z-6,7-epoxy-ligustilide(3)、Z-8-hydroxy-butylidenephthalide(4)、SenkyunolideA(5)、Neocnidilide(6)、Z-3-butylidene-7-methoxyphthalide(7)、Z-6.8',7.3'-diligustilide(8)、Tokinolide B(9)、Vanillin(10)、2-methoxy-4-(3-methoxy-1-propeny1)-pheno1(11)、Senkyunolide C(12)。对分离获得的化合物,本研究通过蛋白质免疫印迹生物活性模型进行检测。最终遴选得到较具有潜力的二聚体苯酞类化合物Tokinolide B(9)。接着,我们利用MTT、Annexin V/PI双染法、双荧光素酶报告基因法、蛋白质免疫印迹法、免疫荧光染色、细胞核质分离等方法进一步探讨TokinolideB的作用机制。相比曾报道的有效成分丁烯基苯酞,该化合物能更好地调控核受体TR3的表达,而且能更好地诱导肿瘤细胞凋亡。蛋白质免疫印迹分析表明TB明显地诱导肺癌细胞中PARP的切割,采用流式细胞仪Annexin V/PI双染检测也表明TB能显著诱导癌细胞凋亡。进一步的分析发现,TB能依赖性地激活Caspase-8和Caspase-3诱导PARP切割。报告基因及蛋白质免疫印迹分析表明该化合物能浓度和时间依赖地激活核受体TR3的基因和蛋白表达,免疫荧光染色及核质分离结果均表明TB调控TR3出核。利用RNA干扰技术证明了 TB所诱导的细胞凋亡与TR3有关。更进一步的实验检测发现,用TB处理肺癌细胞时,随着处理时间的增加,TR3表达增加的同时,P-P38、P-JNK的蛋白表达量增加,表明TB可能通过激活P38和JNK进而修饰核受体TR3从而调控其蛋白定位及诱导细胞凋亡。以上结果表明TokinolideB具有调控核受体TR3信号通路促进肿瘤细胞凋亡的作用。总之,本研究通过筛选川芎中的苯酞类化合物,发现TokinolideB能够靶向调控TR3细胞凋亡信号通路诱导癌细胞凋亡,为靶向TR3核受体抗肿瘤提供一个新的先导化合物或候选药物。同时,这也为传统中药川芎在抗肿瘤方面的新应用提供实验基础。