基于肝毒性的雷公藤复方配伍减毒研究

目的：观察中药配伍对雷公藤肝毒性的影响及其可能的作用机制 方法：1、大鼠随机分为空白对照组、雷公藤多苷阳性对照组、雷公藤水提液低剂量组、雷公藤水提液高剂量组,空白对照组给予同体积的溶媒溶液。连续灌胃给药四周,于第四周末麻醉大鼠,取血,分离血清,血生化分析仪检测丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(Glu)、甘油三酯(TG)的含量；处死大鼠,取肝脏,一部分甲醛固定做病理学检测,一部分冰生理盐水制备10%肝组织匀浆,并检测其超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和细胞色素P450酶(Cyt P450)的含量。2、大鼠随机分为空白对照组、雷公藤单药组、雷公藤复方组、雷公藤+生地组、雷公藤+青风藤组、雷公藤+僵蚕组、雷公藤+三七组、复方-生地组、复方-青风藤组、复方-僵蚕组、复方-三七组,空白对照组给予同体积的溶媒溶液。连续灌胃给药四周,于第四周末麻醉大鼠,取血,分离血清,血生化分析仪检测丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(Glu)、甘油三酯(TG)的含量；处死大鼠,取肝脏,一部分甲醛固定做病理学检测,一部分冰生理盐水制备10%肝组织匀浆,并检测其超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和细胞色素P450酶(Cyt P450)的含量。3、建立肝细胞立体培养体系,并在此体系的基础上作以下研究：(1)MTT法观察雷公藤对肝细胞活力的影响；检测经雷公藤作用后细胞上清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)以及细胞裂解样品中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和细胞色素P450酶(Cyt P450)的含量。(2)运用不同配伍组合的药物(雷公藤、雷公藤复方、雷公藤+生地、雷公藤+青风藤、雷公藤+僵蚕、雷公藤+三七)作用于肝细胞,MTT法观察各组对肝细胞活力的影响,检测各组上清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)以及细胞裂解样品中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和细胞色素P450酶(Cyt P450)的含量。 结果：1、雷公藤灌胃给药四周后,和空白对照组比较,两个剂量的雷公藤水提液和雷公藤多苷水溶液均可使大鼠血清中ALT、AS1、LDH水平升高,TP、ALB、TBIL含量降低,肝组织匀浆中MDA水平升高,SOD与CytP450酶含量降低,Glu、TG等也产生剂量依赖性变化。其中,雷公藤多苷水提液组和雷公藤高剂量组变化更为显著(P<0.05,P<0.01)；病理结果显示,给药组大鼠肝脏出现病理性改变,其中,雷公藤多苷水提液组和雷公藤高剂量组大鼠肝脏出现肝细胞脂肪变性,炎细胞侵润,部分动物肝脏出现点、片状坏死 2、连续灌胃给药一个月后,和空白对照组比较,雷公藤单药组大鼠血清中ALT、AST水平升高,TP、ALB含量降低,肝组织匀浆中MDA水平升高,SOD及CytP450酶含量降低,复方则未有显著性改变。单味中药与雷公藤配伍后,发现生地和三七的使用可改善雷公藤引起的指标水平变化,青风藤的使用则会加重。病理结果显示,单药组大鼠肝脏出现肝细胞脂肪变性,炎细胞侵润,部分动物肝脏出现点、片状坏死,复方组则没有出现病理性改变,雷公藤+生地组和雷公藤+三七组大鼠脂肪变性范围较小,而雷公藤配伍青风藤组大鼠则加重。 3、在立体培养的细胞模型基础上对中药配伍雷公藤对其引起的细胞毒性进行研究,实验结果显示：雷公藤作用于肝细胞后,导致肝细胞ALI、AST、LDH释放增加,SOD水平降低,MDA水平升高,Cyt P450酶含量降低；和中药配伍后显示,配伍生地/三七的组别肝细胞ALT、AST、LDH释放减少,SOD水平升高,MDA水平降低,Cyt P450酶含量叫雷公藤单药组也有一定程度的升高,而配伍青风藤的组别肝细胞ALT、AST、LDH释放增加,SOD水平降低,MDA水平升高,Cyt P450酶含量降低。Real time PCR检测CytP450酶三种亚型的含量,检测结果表明：和雷公藤单药组对比,配伍生地/三七使肝细胞Cyt P1A2、Cyt P2E1、Cyt P3A三种亚型含量升高,而青风藤和僵蚕的配伍则使其含量降低。 结论：通过对雷公藤肝毒性体内和体外的综合研究,揭示了雷公藤对肝脏的毒性作用可能是通过影响CytP450酶系的代谢功能,进一步引起过度脂质过氧化而导致细胞死亡。将不同中药与雷公藤配伍后分别进行体内和体外的研究,实验结果揭示,生地和三七与雷公藤配伍使用后,能明显改善雷公藤引起的肝损伤,青风藤的加入则会导致雷公藤所致肝损伤加重,综合指标变化情况分析,CytP450酶系的改变比较显著,因此我们推测,在由雷公藤、生地、青风藤、僵蚕、三七组成的雷公藤复方中,生地和三七通过影响CytP450酶的代谢功能进而防止过度脂质过氧化来降低雷公藤所致的肝脏毒性,青风藤在复方中发挥增效而非减毒的作用。