广东梅州商品红菇属于红菇目红菇科红菇属,是一种美味的野生菌根性食用菌。该菇味道香甜,口感脆滑,在广东梅州地区有多年食用的历史,市场交易规模较大。红菇属真菌形态变异很大,以至于该属的分类一直比较混乱,广东梅州商品红菇的分类长期存在着争议。本论文通过野外生态因子调查,子实体、菌根、孢子等形态显微观察,结合DNA中内部转录间隔区(ITS)及大亚基(LSU)序列分析,首次对广东梅州商品红菇进行形态学与分子学鉴定；进一步系统测定和分析了该商品红菇营养成分及功能成分；运用滤纸片扩散法评价了该红菇抗菌活性并通过GC-MS联用分析了该红菇挥发油及石油醚萃取物的化学成分；然后采用四种抗氧化测定方法评价了该红菇的抗氧化作用,检测了其抗氧化活性成分,研究了该商品红菇的抗氧化活性与黄酮和多酚含量的相关性,以及初步探讨其清除自由基的作用机理。主要研究内容和结果如下：
1)广东梅州商品红菇形态显微观察
通过野外生态调查和显微镜技术分别对广东梅州商品进行了生态学和组织学研究。结果表明,广东梅州商品是一种外生菌根菌,在相对稳定的生态环境条件下,出菇的最适气温是24-32℃,相对空气湿度达80%-100%,土壤含水量达到40%以上,湿度是主导因子。每年在夏末秋初高温阵雨之后为发生盛期,发生地林间郁闭度0.9左右,土壤pH值3-4,其共生树种为壳斗科植物。广东梅州商品红菇颜色以红色为主,囊状体特别发达,菌肉灰色,菌髓为异型菌髓,担孢子近球形,孢子大小为8.55-10.29×10.65-11.01μm,孢子表面有脊状突起,其高度约1.14μm,宽0.57μm,相邻脊间最宽距离2.14μm。确证该商品红菇菌丝细胞与细胞连接处没有锁状联合。
2)广东梅州商品红菇分子鉴定
实验采用核酸序列分析法,对采自广西浦北、福建上杭和广东梅州的8个商品红菇子实体的rDNA ITS(Internal Transcribed Spacer)以及28S rDNA区段进行克隆测序和序列特征比较分析,并对rDNA ITS序列进行核酸序列数据库GenBank同源性检索比对,将从GeneBank检索获得的相似物种rDNA ITS以及28S rDNA区段序列构建系统发育树。rDNAITS序列比较结果表明,8个红菇属菌株的rDNAITS序列长度为681bp-699bp, GC含量为48.56%-49.64%,子实体R1、R2、R3、R6和R8的rDNA ITS区段与GenBank中已知灰肉红菇(Russula griseocarnosa)的相似率达99%,其余几株与灰肉红菇的相似率低于95%。由此推断,从广西浦北和广东梅州隆文采集的商品红菇子实体是灰肉红菇,但在广东梅州、福建上杭产区可能存在多种食用红菇共同生长。
对多种红菇属真菌的ITS序列和LSU序列系统发育关系的研究表明,8株不同产地(来源)的红菇聚在一起,表明它们之间有相对较密切的亲缘关系。从ITS序列构成的系统发育树看,R1、R2、R6、R7与R. griseocarnosa聚成一支,R3、R4、R5、R8与R. emetica聚在一起。从LSU序列构成的系统发育树看,8个红菇属菌株与Russula vinosa聚成一支。无论是ITS序列还是LSU序列构造的发育树均证明所测的各菌株之间大多存在一定的变异。
3)灰肉红菇营养成分分析
按照国家标准方法对采自广东梅州隆文灰肉红菇的一般营养成分进行分析,结果表明：菌盖和菌柄中粗蛋白,粗脂肪,粗纤维,灰分,还原糖,碳水化合物含量分别为32.31%,19.10%；7.17%,5.18%；8.85%,11.72%；7.84%,6.59%；2.11%,1.97%;49.10%,62.68%。
采用氨基酸分析仪、原子吸收分光光度计、HPLC、GC/MS等方法对灰肉红菇的营养成分进一步分析结果表明：灰肉红菇子实体中含有磷、钾、铁、钠、钙、镁、锌等多种具有生理活性的矿物质元素。子实体菌盖和菌柄中K/Na比分别高达14.78和31.7。菌盖和菌柄中都含有7种脂肪酸,主要是油酸、亚油酸和棕榈酸,子实体菌盖中油酸含量最高,为47.92%；菌柄中亚油酸含量最高,为50.22%。全氨基酸分析表明含有17种氨基酸,菌盖和菌柄中氨基酸总量不同,分别占子实体干重的12.75%和8.98%。人体必需的7种氨基酸齐全(色氨酸未测),菌盖和菌柄中必需氨基酸分别占氨基酸总量的46.04%和52.18%。
4)灰肉红菇抗菌活性
利用滤纸片扩散法对灰肉红菇抗菌活性进行了研究并通过GC-MS联用分析了灰肉红菇挥发油及石油醚萃取物的化学成分。结果表明：灰肉红菇中挥发油对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌以及沙门氏菌均有明显的抑制作用。石油醚萃取物对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌有明显的抑制作用。子实体乙醇提取物总体抑菌作用不明显。灰肉红菇挥发油中的主要化学成分为酮、烷烃、醛、烯烃等化合物,而石油醚萃取物主要成分为酸、酯、烯烃、醇等化合物。
5)灰肉红菇抗氧化活性的测定
从还原能力、DPPH清除率等和对不同体系产生的活性氧自由基清除效果等方面对灰肉红菇提取物的抗氧化活性进行了试验研究和评价。结果表明灰肉红菇提取物具有较强的还原能力,对DPPH、Fenton反应产生的羟自由基的抑制作用或清除作用,以及通过螯合金属来抑制金属对脂质氧化的催化作用。通过抗氧化性与总酚和黄酮相关性分析表明：还原力与总酚含量相关(R2=0.7831),清除DPPH自由基与黄酮含量相关(R2=0.816),还原力与黄酮含量相关(R2=0.8527),可知黄酮的抗氧化能力主要体现在还原力上。
6)抗氧化活性成分的检测
采用依利特Hypersil BDS-C18色谱柱(200 mm×4.6 mm,5μm)),甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相,梯度洗脱,流速为1.0 mL/min, SPM-M10AVP紫外检测器,25℃柱温,检测波长273 nm的高效液相色谱法对灰肉红菇提取物抗氧化活性成分—酚类物质进行定性定量检测。以5种不同黄酮类化合物和8种酚酸为对照品,检测出灰肉红菇中咖啡酸、槲皮素以及原儿茶酸3种抗氧化活性物质,其中以槲皮素的含量最高,达95.82μg/g。
