瘦素对胰岛素合成、分泌和信号转导的影响

第一部分 瘦素受体mRNA的表达与分布 目的 瘦素受体的分布范围广泛，来源于小鼠的OB-R分布于脉络丛、下丘脑、睾丸等处，而胰腺内是否有分布尚有争议，Tartaglia，Emilsson等认为胰腺内有功能性OB-R的分布，而Murakami T则认为无此受体分布。本试验进一步探讨并证实OB-R的分布。 方法 选取4-6周龄的C57／BL6小鼠15只，手术获取小鼠胰腺、心脏、肝脏、下丘脑等组织，应用免疫组织化学及RT-PCR方法检测OB-R的存在。采用多克隆抗体法检测OB-Rb。OB-Rb的引物序列为：SS 5'-AGA ATT GTT CCT GGG CAC AAG，AS 5'-ACA CTC ATC CTC ACA GGT TCC。PCR反应条件为95℃变性5分钟，94℃ 60S变性，55℃60S退火，72℃ 60S延伸，反应进行30个循环。72℃延伸7分钟，反应结束后琼脂糖凝胶电泳检测。 结果 免疫组织化学方法证实，瘦素受体在C57／BL6小鼠的脑、胰腺、肝脏、心脏、肾脏、脂肪等组织中均有表达，各组织胞浆内为棕色表达，阴性为均一的蓝染。RT-PCR方法证实，瘦素受体在C57／BL6小鼠的脑、胰腺、肝脏、心脏、肾脏、脂肪等组织中可见清晰的条带。 结论 除C57／BL6小鼠的下丘脑、心脏、肝脏、肾脏、脂肪组织外，瘦素受体在胰腺中有分布及表达。因此，瘦素与胰腺上存在的瘦素受体结合就可能对胰岛素的合成和分泌产生影响。 第二部分 瘦素灌注对大鼠胰岛素分泌的影响 目的：通过静脉给予瘦素及阻断交感神经系统来检测瘦素对胰岛素的作用。 方法：选取144只约6周龄(体质量约200kg)SD雄性大鼠作为实验对象。将72只SD大鼠分成2组(迷走神经切断组，迷走神经切断加静脉糖负荷组)作为预实验，摸索对胰岛素作用明显的瘦素浓度。根据其结果，将其余72只SD大鼠股动静脉插管后分成6组(正常组，迷走神经切断组，迷走神经切断后加6-OHDA化学性交感神经阻断组，正常加静脉糖负荷组，迷走神经切断加静脉糖负荷组，迷走神经切断后加6-OHDA化学性交感神经阻断加静脉糖负荷组)。每组6只SD大鼠接受静脉注射瘦素(10nmol／kg)或对照PBS缓冲剂或同时加静脉糖负荷，于0，3，6，30分从股动脉取血测胰岛素浓度。 结果：(1)、瘦素在较低浓度时对胰岛素无明显作用，随着浓度的增加逐渐显示出其对胰岛素的抑制作用。瘦素在10nmol／kgBW时显著的抑制血浆胰岛素的分泌，尤其静脉糖负荷后。说明瘦素对胰岛素具有抑制作用，并呈一定的剂量依赖性。(2)在迷走神经切断的大鼠，瘦素能够抑制血浆胰岛素分泌并在静脉糖负荷后增强其作用，而在迷走神经切断与化学性交感神经阻断的大鼠中瘦素的这种作用减弱。 结论：瘦素对胰岛素具有抑制作用，并呈一定的剂量依赖性。瘦素亦可通过自主神经系统的介导来抑制胰岛素分泌的作用。 第三部分 瘦素对离体胰岛细胞胰岛素分泌的影响 目的：通过体外培养大鼠胰岛细胞的方法研究瘦素对葡萄糖刺激的胰岛素分泌的影响。 方法：取体重在250g-350g之间的SD大鼠为实验对象，分离并纯化其胰岛细胞。将胰岛细胞放于营养液中在培养箱中培养2小时，然后换营养液再培养1小时。以10个胰岛为一个单位，放于一个培养孔中。首先观察瘦素对不同浓度的葡萄糖刺激的胰岛素分泌的影响，并摸索对胰岛素作用明显时的葡萄糖的浓度。将22个培养孔分成实验组和对照组，实验组中加入11种不同浓度(4mM-24mM)的葡萄糖溶液、瘦素(10mM)，对照组中加入11种不同浓度的葡萄糖溶液、PBS液，培养2小时后用放免的方法测定培养液中胰岛素的量。根据其结果，再取22单位的胰岛，观察22种不同浓度(0-1000ng／ml)的瘦素对胰岛素分泌的影响。每个培养孔中加入葡萄糖液(12mM)和一种浓度的瘦素，共同培养30分钟后用放免的方法测定培养液中胰岛素的量。 结果：在不同浓度的葡萄糖刺激下，瘦素(10mM)对胰岛素的分泌呈抑制作用，其中葡萄糖的浓度在12mM的时候抑制作用最明显。不同浓度的瘦素对葡萄糖(12mM)刺激的胰岛素分泌的影响呈双向性，太低和太高浓度都不能明显抑制胰岛素的分泌，只是在适宜的浓度下才能起到抑制作用。 结论：瘦素对不同浓度葡萄糖刺激的胰岛素分泌呈抑制作用，不同浓度的瘦素对胰岛素分泌的影响呈双向性，只是在适宜的浓度下才能起到抑制作用。 第四部分 瘦素对大鼠前胰岛素原mRNA表达的影响 目的 瘦素对胰岛素的影响成为近年来研究的热点，瘦素对胰岛素分泌的双向调节作用逐渐被人们发现，但是瘦素对胰岛素合成的影响研究甚少，并且瘦素对大鼠前胰岛素原的影响无人报道。本实验目的在于探讨瘦素在不同条件下对大鼠前胰岛素原mRNA表达的影响。 方法 250-300gSD大鼠96只，雌雄不拘，随机分成8组。第1，2组为在体实验，其余组均为离体实验。离体实验中根据培养基条件不同分为葡萄糖浓度5.6mmol／L培养24小时组，葡萄糖浓度20.0mmol／L培养2小时组，葡萄糖浓度20.0mmol／L培养24小时组。应用半定量RT-PCR技术检测各组前胰岛素原Ⅰ、ⅡmRNA的表达。 结果 ①正常葡萄糖浓度时，无论在体、离体实验，瘦素组大鼠前胰岛素原mRNA表达的变化均无统计学意义。②20mM葡萄糖浓度，体外培养2h时，瘦素组与对照组大鼠前胰岛素原mRNA表达的变化无显著性差异。③20mM葡萄糖浓度，体外培养24h时，瘦素组大鼠前胰岛素原mRNA的表达明显减少。 结论 对于SD大鼠：①瘦素直接抑制前胰岛素原mRNA的表达。②瘦素抑制前胰岛素原mRNA的表达呈时间依赖。③瘦素抑制前胰岛素原mRNA的表达呈葡萄糖浓度依赖。这些结果提示瘦素对胰岛β细胞合成胰岛素功能有抑制作用。 第五部分 瘦素对胰岛素受体后信号转导途径的影响 目的 瘦素对胰岛素的合成和分泌均有影响，本文观察瘦素对胰岛素受体后信号转导途径的影响。 方法 胰岛细胞在10cm的培养皿，在37℃，5％的CO2和95％潮湿空气中培养至单层融合。融合的细胞单层分组，分别用0、4、10、12mM瘦素(第1组、第2组、第3组、第4组)预温育16h，然后用12mM瘦素急性刺激1min，未用药物刺激的细胞作为对照组。用免疫沉淀法测定IRB、IRS21和IRS22的酪氨酸磷酸化水平及IRS21／22与P85的相关作用。用免疫印迹法测定IRB、IRS-1、IRS-2、P85的蛋白表达水平，利用Image Quant软件(Molecular Dynamics)对免疫反应条带作自动扫描测量光密度，并转换成相对百分数。 结果 在基础状态下，可检测到的信号分子的酪氨酸磷酸化反应极低。12mM瘦素急性刺激1min迅速引起了IRB、IRS-1和IRS-2的酪氨酸磷酸化、第1组各信号分子的蛋白表达水平、改变差异无显著性。细胞用0、4、10、12mM瘦素温育16h，IRB、IRS-1和IRS-2的酪氨酸磷酸化水平随孵育瘦素浓度的增加而逐渐降低，在12mM瘦素存在下IRB、IRS-1和IRS-2的磷酸化降至最低值。与上述改变相平行，在瘦素处理后，IRS-1与P85的结合反应、IRS-2与P85的结合反应均降低，IRB、IRS-1、IRS-2、PI3K的蛋白表达水平亦降低。 结论 瘦素可能通过PI3K途径影响胰岛素受体后信号转导。