氧化三甲胺与动脉粥样硬化关系及痰瘀同治方药的干预的研究

背景:动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是冠心病、脑卒中等心脑血管疾病的基础病理改变,严重影响人类健康和生活质量。AS是引起国人致死和致残的第一位病因。西方现代医学认为,动脉粥样硬化的主要特征是大中型动脉管壁的慢性炎症性改变,表现为脂质沉积、粥样斑块的形成和破裂、炎细胞浸润、内皮功能损害等。目前认为肠道菌群失调与动脉粥样硬化的发生发展有关,TMAO水平改变依赖于肠道菌群,在多个大规模临床观察中发现其升高与冠心病风险相关,TMAO逐渐被认为是动脉粥样硬化的可能致病因子。祖国传统医学认为”痰瘀互结”是动脉粥样硬化的病机之一。中医理论认为“血瘀”在斑块破裂后并发血栓时表现最为显著,而在AS早期,形成粥样斑块以前主要以脂质软斑块为主要病理特征时,则以“痰浊”为重。根据“从痰论治”理论,我们提出”痰瘀同治”的原则,将“治瘀”和“治痰”两者统一,“活血化瘀”法针对斑块破裂后,而”痰瘀同治”法则针对软斑块形成阶段,从而提早干预斑块,更好的改善动脉粥样硬化的预后。我们以汉代张仲景《金匮要略》一书中的著名方剂瓜蒌薤白白酒汤进行加减,形成了新型“痰瘀同治”方药(以下简称痰瘀同治方药)。既往研究已证实,痰瘀同治方药可以改善冠心病患者及动物模型的肠道菌群紊乱,并在动物模型上观察到斑块减退。本实验将主要观察不同程度动脉粥样硬化患者血清TMAO浓度和血管内皮舒张功能及内皮损伤后修复成分-内皮祖细胞的状况,初步发现TMAO与AS严重程度的关系;再进一步在动物实验中验证,并给予痰瘀同治方药干预;在细胞实验中建立TMAO损伤脐静脉内皮细胞的模型,给予不同剂量痰瘀同治方药干预,以期探讨痰瘀同治方药抗动脉粥样硬化的作用。目的:明确TMAO在AS发病中的致病作用,给予“痰瘀同治”方药可通过调节TMAO,改善脂质代谢紊乱及内皮功能,起到抗动脉粥样硬化的作用。方法:第一部分:观察不同程度动脉粥样硬化患者TMAO的浓度和脂质代谢、血管内皮舒张功能的关系:收集2015年5月至2015年11月在长征医院心血管内科住院的冠心病患者,行选择性冠状动脉造影和彩色多普勒超声检测颈总动脉IMT、和肱动脉血流介导的舒张功能(FMD),根据Gensini评分将患者分为正常对照组(n=16),轻度动脉粥样硬化组(n=18),中度动脉粥样硬化组(n=21)和重度动脉粥样硬化组(n=19)。所有患者采集血液标本检测血脂(TG、TC、LDL-C和HDL-C);高效液相色谱串联质谱法测定血清TMAO;采用Griess法测定NO;黄嘌呤氧化酶法测SOD活力,高效液相色谱仪(HPLC)测定血浆中ADMA的含量,用双抗体夹心ABC-ELISA法检测s VCAM-1;行颈动脉超声检查颈总动脉内膜中层厚度测量(IMT),检测肱动脉血流介导的血管舒张(flow-mediated dilation,FMD),同时留取患者外周血进行内皮祖细胞流式细胞分析,将上述临床指标进行统计学分析。第二部分:在LDLr-/-小鼠动脉粥样硬化模型上,观察TMAO与脂质代谢、血管内皮功能及大血管斑块的改变,比较痰瘀同治方药和阿托伐他汀的抗动脉粥样硬化作用。雄性SPF级LDLr基因敲除(LDLr-/-)C57BL小鼠共计24只,适应性喂养2周后,行高脂饮食+左肾动脉限流术,制备动脉粥样硬化模型,继续喂养8周,分别给予痰瘀同治方药和阿托伐他汀进行干预。小鼠随机分为4组,如下:(1)空白对照组(n=6),普通饲料喂养,假手术,蒸馏水(10 ml/kg*d)灌胃;(2)模型对照组(n=6),高脂饲料喂养,左肾动脉限流术,蒸馏水(10 ml/kg*d)灌胃;(3)痰瘀同治方药组(n=6),高脂饲料喂养,行左肾动脉限流术,痰瘀同治方药(0.637mg/g*d)灌胃;(4)阿托伐他汀组(n=6),高脂饲料喂养,行左肾动脉限流术,阿托伐他汀(1mg/kg*d)灌胃;各组干预8周后,麻醉并处死小鼠,制备主动脉起始部切片,进行油红O染色和HE染色,采用免疫组化技术分析斑块稳定性;眼球法采血检测小鼠血脂(TG、TC、LDL-C和HDL-C)、高效液相色谱串联质谱测定血清TMAO,检测血管内皮功能相关因子(NO、SOD和s VCAM-1);检测双侧股骨和胫骨骨髓中内皮祖细胞含量。将上述指标进行统计学分析。第三部分:建立TMAO损伤脐静脉内皮细胞模型,观察痰瘀同治方药改善内皮功能的可能机制。人脐静脉血内皮细胞株来自于复旦大学医学院研究所,体外培养传代及复苏,间接荧光免疫法染色后显微镜下观察,鉴定。MTT法建立TMAO损伤HUVECs模型,分别用浓度0、10、25、50、100、150和200μmol/L的TMAO溶液加入HUVECs,测OD值观察48h后细胞存活率。MTT法观察痰瘀同治方药对HUVECs的干预作用,HUVECs分别加入0、10、25、50、100和150μg/ml痰瘀同治方药处理,观察48小时后细胞存活率。分别给予低中高剂量痰瘀同治方药(25、50、100μg/ml)干预TMAO损伤HUVECs模型,RT-PCR法检测培养液中e NOS m RNA和s ICAM-1 m RNA的表达,Western Bloting法检测e NOS和s ICAM-1蛋白表达,检测细胞培养液NO和s ICAM-1浓度。将上述检测指标进行统计学分析。结果:第一部分:1、与正常对照组相比,不同程度动脉粥样硬化组均存在血脂代谢异常,甘油三脂(TC)总胆固醇(TG)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)显著升高(P<0.05),而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)显著降低(P<0.05)。2、与正常对照组组比,不同程度动脉粥样硬化组患者血清NO和SOD水平明显降低(P<0.05),血清ADMA和s ICAM-1水平显著升高(P<0.05)。3、与正常对照组相比,不同程度动脉粥样硬化组患者血清TMAO明显升高(P<0.05),IMT明显升高(P<0.05),FMD明显降低(P<0.05),外周血内皮祖细胞含量明显降低(P<0.05)。4、血清TMAO水平与Gensini评分正相关关系,Pearson相关系数为0.839(P<0.0001);与LDL-C呈正相关关系,Pearson相关系数为0.5616(P<0.0001);血清TMAO水平与NO呈负相关关系,Pearson相关系数为-0.885(P<0.0001);与SOD呈负相关关系,Pearson相关系数为-0.717(P<0.0001);与ADMA呈正相关关系,Pearson相关系数为0.860(P<0.0001);与s VCAM-1呈正相关关系,Pearson相关系数为0.795(P<0.0001)。5、血清TMAO水平与IMT呈正相关关系,Pearson相关系数为0.623(P<0.0001);与FMD呈负相关关系,Pearson相关系数为-0.726(P<0.0001),与外周血内皮祖细胞含量呈显著负相关,Pearson相关系数为-0.661(P<0.05)。6、血清TMAO>8μmol/L是动脉粥样硬化的一个危险预测因子。第二部分:1、与空白对照组小鼠比较,模型对照组小鼠TC、TG、LDL-C均明显升高,HDL-C明显降低,血浆TMAO明显升高,NO和SOD水平明显下降,s VCAM-1水平明显升高(P<0.05)。2、与模型对照组相比,痰瘀同治方药干预组和阿托伐他汀干预组明显改善小鼠脂质代谢(P<0.05),两组均明显改善血管内皮功能(P<0.05),痰瘀同治方药干预组可以明显降低TMAO浓度(P<0.05),阿托伐他汀干预对TMAO浓度无影响。新方药较模型组可显著升高骨髓内皮祖细胞含量,该作用强于阿托伐他汀(P<0.05)。3、与阿托伐他汀干预组比较,痰瘀同治方药干预组对小鼠脂质代谢和内皮功能的改善无明显差异,痰瘀同治方药干预可以显著降低TMAO(P<0.05)。4、与模型对照组相比,痰瘀同治方药干预组主动脉内/中膜厚度比值显著减小,主动脉粥样斑块中巨噬细胞、脂质含量显著降低(P<0.05),而平滑肌细胞和胶原含量较高(P<0.05);斑块易损指数亦显著减小(P<0.05)。与阿托伐他汀组比较,痰瘀同治方药干预组无明显差异(P<0.05)。第三部分:1、脐静脉内皮细胞(HUVECs)生长良好,经Ⅷ因子相关抗原间接免疫荧光鉴定,所培养的细胞表达较高密度的Ⅷ因子相关抗原,荧光显微镜下可见培养的HUVECs胞浆内有黄绿色荧光。2、TMAO抑制HUVECs模型的建立:将分别为浓度0、10、25、50、100、150和200μmol/L的TMAO作用于HUVECs,其存活率曲线显示,100μmol/LTMAO刺激HUVECs 48小时可以作为其合适浓度。3、HUVECs分别加入0、10、25、50、100和150μg/ml痰瘀同治方药处理,痰瘀同治方药对HUVECs生长无影响。4、建立TMAO损伤模型,分别给予25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml剂量的痰瘀同治方药干预,RT-PCR结果提示培养液中e NOS m RNA表达升高,s ICAM-1 m RNA表达降低;Western Bloting法提示e NOS蛋白表达升高,s ICAM-1蛋白表达降低;细胞培养液中NO浓度升高,s ICAM-1浓度降低。结论:临床观察发现,血清TMAO水平与AS严重程度和血管内皮功能相关,血清TMAO>8μmol/L是动脉粥样硬化的一个危险预测因子。AS模型小鼠痰瘀同治方药干预除了和阿托伐他汀具有相近的调节脂质代谢、改善内皮功能等抗AS作用外,还可以降低TMAO水平,升高骨髓内皮祖细胞含量。细胞实验中证实痰瘀同治方药可以降低TMAO对内皮细胞的毒性作用。痰瘀同治方药改善TMAO的内皮损伤作用,上调内皮细胞e NOS表达,下调其s ICAM-1表达可能是其抗动脉粥样硬化的可能机制之一。