目的:从细胞增殖、造血因子、JAK2/STAT5信号转导通路、细胞周期、细胞凋亡以及细胞分化等方面,探讨黄芪甲苷、毛蕊异黄酮及其配伍对化疗性骨髓抑制小鼠骨髓干细胞的影响与调控机制。材料与方法:1 C57BL/6小鼠20只,雌雄各半,28～32g,购于北京维通利华,实验动物合格号SCXK(京)2012-0001。于实验前l周一次性购入,常规饲养1周以适应环境,给予自由饮水及饮食。参照文献报道,连续3天给小鼠腹腔注射环磷酰胺380mg/kg建立化疗性骨髓抑制模型。造模后,以脱颈椎法将各组小鼠处死,取出小鼠的股骨,剔除其肌肉以及结缔组织,剪开股骨的两端,用6号针头以生理盐水反复冲洗骨髓腔,并将冲出来的骨髓打碎,再用4号针头过滤,制成单个细胞悬液,在离心机上2000rpm,离心10分钟以后去上清液,加入4m L冷70%乙醇固定,上振荡器摇匀,制成骨髓干细胞样本。细胞实验分为6组:即正常组、模型组、“EPO+(G-CSF)”对照组、黄芪甲苷组、毛蕊异黄酮组、两药配伍组。给药量的确定及给药方案:通过预实验确定黄芪甲苷给药0.2mg/ml,毛蕊异黄酮0.01mg/ml,EPO 50u/ml,(G-CSF)50u/ml,给药直接作用于骨髓干细胞体外培养体系中,培养3天,室内18～20℃,20%相对湿度,5%CO2,37℃孵育箱。2 MTT法检测骨髓干细胞生长和增殖情况。3采用ELISA法检测骨髓干细胞中EPO、TGF-β、IL-6和IL-4的蛋白含量。4采用蛋白质印迹Western-blot测定p JAK2和p STAT5的蛋白表达,采用RT-q PCR法检测骨髓干细胞中JAK2、STAT5、SOCS3的m RNA表达。5采用ELISA法测定骨髓干细胞中CDK4蛋白含量,采用RT-q PCR法检测骨髓干细胞中Foxo、Cyclin D1的m RNA表达。6采用ELISA法测定骨髓干细胞中caspase3蛋白含量,采用RT-q PCR法检测骨髓干细胞中BCL-xl、BCL-2和Bax的m RNA表达。7采用蛋白质印迹Western-blot测定GATA1的蛋白表达,采用RT-q PCR法检测骨髓干细胞中对KLF1、BCL11A和NF-E2的m RNA表达。结果:1黄芪甲苷、毛蕊异黄酮及两药配伍对化疗性骨髓抑制小鼠骨髓干细胞增殖和造血因子的影响1.1黄芪甲苷、毛蕊异黄酮及两药配伍对化疗性骨髓抑制小鼠骨髓干细胞增殖的影响1.1.1给药24h后骨髓干细胞生长及增殖的情况与模型组比较,各组都有显著差异(P<0.05)。各治疗组之间比较,与毛蕊异黄酮组比较,黄芪甲苷组、两药配伍组均有显著差异(P<0.05);与对照组比较,黄芪甲苷组、两配伍组均无显著差异(P>0.05)。1.1.2给药48h后骨髓干细胞生长及增殖的情况与模型组比较,各组都有显著差异(P<0.05)。各治疗组之间比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两配伍组均无显著差异(P>0.05)。与对照组比较,毛蕊异黄酮组有显著差异(P<0.05)。与对照组比较,黄芪甲苷组、两配伍组均无显著差异(P>0.05)。1.1.3给药72h后骨髓干细胞生长及增殖的情况与模型组比较,各组都有显著差异(P<0.05)。各治疗组之间比较,与毛蕊异黄酮组比较,黄芪甲苷组、两药配伍组均有显著差异(P<0.05)。与对照组比较,黄芪甲苷组、两药配伍组与对照组均无显著差异(P>0.05)。1.2黄芪甲苷、毛蕊异黄酮及两药配伍对化疗性骨髓抑制小鼠骨髓干细胞中造血因子EPO、TGF-β、IL-6和IL-4蛋白含量的影响1.2.1对EPO蛋白含量的影响与模型组比较,各组都有显著差异(P<0.05)。治疗组之间比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组三组之间的两两比较均有显著差异(P<0.05)。与对照组比较,毛蕊异黄酮组无显著差异(P>0.05)。1.2.2对TGF-β蛋白含量的影响与模型组比较,各组均有明显差异(P<0.05)。治疗组之间比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组三组之间的两两比较均有显著差异(P<0.05)。1.2.3对IL-6蛋白含量的影响与模型组比较,各组均有明显差异(P<0.05)。治疗组之间比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组三组之间的两两比较均无显著差异(P>0.05)。1.2.4对IL-4蛋白含量的影响与模型组比较,各组均有明显差异(P<0.05)。治疗组之间比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组三组之间的两两比较均有显著差异(P<0.05)。2黄芪甲苷、毛蕊异黄酮及两药配伍对化疗性骨髓抑制小鼠骨髓干细胞JAK2/STAT5信号转导通路的影响2.1对JAK2 m RNA表达的影响与模型组比较,各组均有明显差异(P<0.05)。治疗组之间比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组三组之间的两两比较均无显著差异(P>0.05)。与对照组比较,黄芪甲苷组、毛蕊异黄酮组、两药配伍组均无显著差异(P>0.05)。2.2对STAT5 m RNA表达的影响与模型组比较,各组均有明显差异(P<0.05)。治疗组之间比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组三组之间的两两比较均无显著差异(P>0.05)。与对照组比较,黄芪甲苷组、蕊异黄酮组、两药配伍组均无显著差异(P>0.05)。2.3对SOCS3 m RNA表达的影响与模型组比较,各组均有明显差异(P<0.05)。治疗组之间比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组三组之间的两两比较均无显著差异(P>0.05)。与对照组比较,黄芪甲苷组、毛蕊异黄酮组、两药配伍组均无显著差异(P>0.05)。2.4对p JAK2蛋白表达的影响与模型组比较,各组均有明显差异(P<0.05)。治疗组之间比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组三组之间的两两比较均无显著差异(P>0.05)。与对照组比较,毛蕊异黄酮组、两药配伍组均无显著差异(P>0.05)。2.5对p STAT5蛋白表达的影响与模型组比较,各组均有明显差异(P<0.05)。治疗组之间比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组三组之间的两两比较均无显著差异(P>0.05)。与对照组比较,黄芪甲苷组、毛蕊异黄酮组、两药配伍组均无显著差异(P>0.05)。3黄芪甲苷、毛蕊异黄酮及两药配伍对化疗性骨髓抑制小鼠骨髓干细胞中细胞周期机制、细胞凋亡机制、分化调控机制的影响3.1黄芪甲苷、毛蕊异黄酮及两药配伍对化疗性骨髓抑制小鼠骨髓干细胞中细胞周期因子Foxo、Cyclin D1以及CDK4的影响3.1.1对Foxo m RNA的表达的影响与模型组比较,各组均有明显差异(P<0.05)。治疗组之间比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组三组之间的两两比较均无显著差异(P>0.05)。与对照组比较,黄芪甲苷组、蕊异黄酮组、两药配伍组均无显著差异(P>0.05)。3.1.2对Cyclin D1 m RNA表达的影响与模型组比较,各组均有明显差异(P<0.05)。治疗组之间比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组三组之间的两两比较均无显著差异(P>0.05)。与对照组比较,黄芪甲苷组、蕊异黄酮组、两药配伍组均无显著差异(P>0.05)。3.1.3对CDK4蛋白含量的影响与模型组比较,各组均有明显差异(P<0.05)。治疗组之间比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组三组之间的两两比较均无显著差异(P>0.05)。与对照组比较,毛蕊异黄酮组无显著差异(P>0.05)。3.2黄芪甲苷、毛蕊异黄酮及两药配伍对化疗性骨髓抑制小鼠骨髓干细胞中细胞凋亡因子BCL-2、BCL-xl、Bax和caspase3的影响3.2.1对BCL-2 m RNA的表达的影响与模型组比较,各组均有明显差异(P<0.05)。治疗组之间比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组三组之间的两两比较均无显著差异(P>0.05)。与对照组比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组均无显著差异(P>0.05)。3.2.2对BCL-xl m RNA表达的影响与模型组比较,各组均有明显差异(P<0.05)。治疗组之间比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组三组之间的两两比较均无显著差异(P>0.05)。与对照组比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组均无显著差异(P>0.05)。3.2.3对Bax m RNA表达的影响与模型组比较,各组均有明显差异(P<0.05)。治疗组之间比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组三组之间的两两比较均无显著差异(P>0.05)。与对照组比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组均无显著差异(P>0.05)。3.2.4对caspase3的蛋白含量的影响与模型组比较,各组均有明显差异(P<0.05)。治疗组之间比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组三组之间有显著差异(P<0.05)。与对照组比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组均有显著差异(P<0.05)。3.3黄芪甲苷、毛蕊异黄酮及两药配伍对化疗性骨髓抑制小鼠骨髓干细胞的分化调控因子GATA1、KLF1、BCL11A、NF-E2的影响3.3.1对GATA1蛋白表达的影响与模型组比较,各组均有明显差异(P<0.05)。治疗组之间比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组三组之间的两两比较均无显著差异(P>0.05)。与对照组比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组均无显著差异(P>0.05)。3.3.2对KLF1 m RNA表达的影响与模型组比较,各组均有明显差异(P<0.05)。治疗组之间比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组三组之间的两两比较均无显著差异(P>0.05)。与对照组比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组均无显著差异(P>0.05)。3.3.3对BCL11A m RNA表达的影响与模型组比较,各组均有明显差异(P<0.05)。治疗组之间比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组三组之间的两两比较均无显著差异(P>0.05)。与对照组比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组均无显著差异(P>0.05)。3.3.4对NF-E2 m RNA表达的影响与模型组比较,各组均有明显差异(P<0.05)。治疗组之间比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组三组之间的两两比较均无显著差异(P>0.05)。与对照组比较,毛蕊异黄酮组、黄芪甲苷组、两药配伍组均无显著差异(P>0.05)。结论:1黄芪甲苷、毛蕊异黄酮及其配伍能够促进化疗性骨髓抑制小鼠骨髓干细胞增殖,黄芪甲苷、两药配伍的作用优于毛蕊异黄酮。2黄芪甲苷、毛蕊异黄酮及其配伍能够上调EPO、TGF-β、IL-4的蛋白含量,下调IL-6的蛋白含量,黄芪甲苷、两药配伍的作用优于毛蕊异黄酮。3黄芪甲苷、毛蕊异黄酮及其配伍能够上调JAK2、STAT5 m RNA表达,促进p JAK2、p STAT5蛋白表达,下调SOCS3 m RNA表达,黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、两药配伍的作用基本相近。4黄芪甲苷、毛蕊异黄酮及两药配伍能够激活JAK2/STAT5信号转导通路。5黄芪甲苷、毛蕊异黄酮及两药配伍能够上调Cyclin D1 m RNA表达,提高CDK4的蛋白含量,下调细胞周期抑制因子FOXO m RNA的表达,黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、两药配伍的作用基本相近。6黄芪甲苷、毛蕊异黄酮及两药配伍能够上调胞凋亡因子Bcl-2和Bc L-xl的m RNA表达,下调Bax的m RNA表达,并降低Caspase3的蛋白含量,黄芪甲苷的作用优于两药配伍。7黄芪甲苷、毛蕊异黄酮及两药配伍能够上调小鼠骨髓干细胞的珠蛋白基因调控网络因子的KLF1 m RNA、BCL11A m RNA、NF-E2 m RNA的表达水平,促进GATA1蛋白表达,黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、两药配伍的作用基本相近。
