黄芪提取物干预食管癌细胞Ec9706/cDDP polβ的研究

食管癌是一种起源于食管上皮的恶性肿瘤，临床上鳞癌多见，近年来腺癌、未分化癌及其他类型癌亦有增多趋势，本病在全世界恶性肿瘤病种中都属常见，在我们中国以河南、河北为首的某些省份以及江苏、山西、陕西等省份的局部地区，食管癌的年新发病人数以及死亡人数在各类恶性肿瘤中也一直居高。对人们的健康生存构成极大威胁，并成为了患者及其家庭成员重大的心理和经济负担。但基于食管癌早期症状的不典型性，往往疾病进展期才获得临床干预，治疗手段变得单一，这使得化疗在本病治疗中的地位日益凸显。然而随着化学治疗药物应用的普及，近年来肿瘤耐药性也逐渐为人们所重视。这也成了临床治疗能否持续有效的主要影响因素。造成肿瘤细胞对药物低反应性的原因多样且复杂，近年来国内外学者对肿瘤耐药机制及其逆转方法进行了大量研究，这也为克服肿瘤细胞耐药提供了除开发新型抗癌药物外的新方向，即寻找能够逆转化疗耐药的逆转剂。近年来研究者渐渐发现并关注到DNA聚合酶β在化疗低敏肿瘤细胞中的异常表达。国内外研究人员对西药逆转剂进行了广泛探索，但难于克服的正常组织毒性、新药开发技术难度及不菲成本等，严重限制了其开发进程。基于广泛抗肿瘤应用，以及低毒性、多靶点作用等特点，人们逐渐将研究方向定位于天然中草药，黄芪即是其中之一。 目的：黄芪是临床常用抗肿瘤中药之一，具有多种途径的抗肿瘤机制，其抗肿瘤药理研究及逆转实验备受关注。本项目采用现代实验医学的技术手段对Ec9706/cDDP细胞系进行研究并将其具体实验指标进行量化，观察实验组中polβ基因表达水平的变化，探讨黄芪提取物(Astragalus extract，AE)干预后，食管癌耐药细胞化疗敏感性有效提升与polβ表达变化的相关联系，以期拓展中药逆转耐药的研究方法，并为中药逆转肿瘤耐药提供一定的实验药理学依据。 方法：①以加入顺铂的RPMI-1640作为Ec9706/cDDP的培养基；用MTT法检测AE对参与实验细胞的毒性强度，确定无细胞毒性的逆转耐药实验所需浓度；用MTT法分别检测加与不加AE两组Ec9706/cDDP细胞培养48h后的细胞存活率，对两组实验数据行直线回归统计，确定每一组别的半数抑制浓度(IC50)，再进一步计算出对照组实验数据与实验组的倍数关系即逆转倍数。②将细胞系分为对照组和实验组，实验组细胞系给予AE干预，用RT-PCR法检测各组polβ的表达水平。③所有实验数据一律选择SPSS17.0进行规范化处理，数据用x±S进行标注，IC50采用直线回归法进行计算，采用t检验法对比两组数据统计差异。 结果：①黄芪提取物达一定浓度后对Ec9706/cDDP表现出一定的细胞毒性作用，而这种作用的强度与AE浓度呈现正相关。10μg/mL及此浓度以下的低剂量组抑制率与对照组相比显示差异不显著(P＞0.05)，100μg/mL组及更高浓度组抑制率达到18.8%和30.9%，与对照组进行t检验进行比较,统计学差异显著(P＜0.05)。是以选择10μg/mL浓度的无细胞毒性AE进行实验干预。②DDP单独应用对实验细胞的半数抑制浓度为42.49μg/mL，AE非细胞毒性剂量10μg/ml与DDP共同应用，半数抑制浓度降低为25.17μg/mL，二者差异达1.69倍。③以RT-PCR法检测两组细胞polβ的表达水平,对照组10个样本中9个为高水平表达，1个低水平表达；实验组10个样本中2个为高水平表达，余下8个为低水平表达。统计比对分析两组实验数据，polβ表达水平差异显著，具有统计学意义（P＜0.05）。 结论：①AE对Ec9706/cDDP细胞具有细胞毒作用，而其毒性与AE浓度相关。②单独应用DDP，对耐药细胞系的IC50为42.49μg/mL，10μg/mL非细胞毒性剂量的AE与DDP共同作用，IC50下降至25.17μg/mL，逆转1.69倍。显示AE能使实验细胞对DDP的低敏感性得到部分逆转。③RT-PCR法检测两组细胞polβ表达水平,实验组表达水平显著下降，表明一定浓度范围的AE可以下调Ec9706/cDDP polβ基因的表达水平，这或许是AE改善实验细胞系耐药的相关靶点。