登革热湿热证动物模型构建及清热祛湿法作用机理探讨研究

背景： 发现登革热迄今至少有200多年的历史,进入20世纪,登革热在世界范围内的流行规模不断扩大,流行频度不断增加。登革热一度在我国绝迹30余年,1978年首次在佛山市报道登革热暴发疫情,继而在东南沿海频频流行。其中广东省是登革热流行的重灾区,而全省的63%发生在广州。随着广州城市化的进程,登革热流行有上升的趋势,控制效果如何,直接影响一个城市的经济和形象。如何有效防治登革热,成为亟待解决的公共卫生课题。 登革热西医治疗目前尚无特效方法,主要采用对症、支持疗法。中医药治疗(尤其是岭南温病指导下)登革热有独特的疗效,如何对中医药疗法进一步研究,合适的动物模型是关键。 目的： 通过文献综述、临床病例回顾性研究,了解中医药治疗登革热的概况,以及既往模型研究的薄弱环节,借以寻求启发：通过不同鼠类、不同热暴露方式和不同攻毒模式等复合因素来造模,筛选较为理想的登革热湿热证动物模型；在此基础上,验证清热祛湿法的治疗效果及作用靶点,研究湿热证与水通道蛋白的关系。 方法： 1、文献研究：采用文献综述的形式,整理出中医药对登革热的认识和诊疗概况,以及登革热鼠类模型的研究进展,分析岭南登革热的湿热特征,注重其对本次实验和临床研究的启发作用。 2、实验研究：分模型建立和评价,以及清热祛湿法干预作用探讨两部分。 ①、登革热湿热证模型的建立：本实验动物分4周龄左右的BALB／c和C57BL／6小鼠,分热习服和短暂热暴露,以及分作单次登革热病毒2感染(简称DF2)和ADE效应(简称ADE)两种不同的攻毒模式；按照排列组合原则,得8个造模组,同时设立空白对照组、单纯DF2对照组、湿热条件对照组,共得14组。观察实验小鼠体温、症状、体征,以及检测血小板(PLT)、肝功能(ALT、AST)、血脂(TG、CHOL)和肝脏病理等,来评价造模效果,筛选出最佳登革热湿热证动物模型； ②、不同药物对登革热模型小鼠干预作用比较及机理探讨：选用实验一筛选出的动物随机分为5组：模型组、蒿芩清胆汤治疗组、清瘟败毒饮治疗组、病毒唑治疗组、生理盐水治疗组,再设立正常对照组,观察各组实验小鼠体温、症状、体征,检测血小板(PLT)、肝功能(ALT、AST)、血脂(TG、CHOL)和肝脏病理,以及脑水通道蛋白4(AQP4)、肾水通道蛋白2(AQP4)、胃水通道蛋白4(AQP4)；比较各种治疗药物的治疗作用,探讨不同治法的治疗机理。 3、临床研究：回顾研究2006年451个广州市第八人民医院住院病例；按照统一标准分为湿热疫和暑燥疫,观察两组患者年龄分布,比较其平均年龄、性别、体温峰值、皮疹发病率、肝功能损害(ALT、AST升高)情况、血小板水平等；再区分两组患者中,结合中医辨证施治者和单纯西医治疗者,比较其平均退热时间、皮疹消退时间、血小板复常时间、平均病程及ALT、AST水平的影响,以判断其治疗效果。 结果： 1文献研究：①、岭南温病的湿热特征对登革热具有一定影响；②、中医药治疗登革热疗效优于单纯西医治疗；③、登革热模型不够理想,有诸多原因,思维方面没有突破可能是重要的原因之一：④、“病证结合”思想的应用在登革热湿热证动物造模方面的应用大有前途。 2、实验研究： ①、一般表现：小鼠病毒攻击后出现疲倦状态,体温稍降低,活动明显减少,对刺激反应慢,毛发耸立不顺,欠光泽,饮食、饮水量减少,小便较臭、大便较正常组软；进入气候仓后表现出现烦躁不安,活动增加,食量减少,饮水增多,渐渐至倦卧,对刺激反应慢,多次放入气候仓后形成热习服,则与正常小鼠无明显差异。BALB/c和C57BL／6小鼠之间相差不大。蒿芩清胆汤对改善造模组的症状有一定作用； ②、体温检测：各组小鼠病毒攻击后出现体温下降,然后逐渐恢复正常；短暂热暴露可造成体温升高,热习服后则升高不明显,各组间存在差异。蒿芩清胆汤及清瘟败毒饮有降低体温的作用； ③、主要指标的检测：小鼠病毒攻击后,PLT变化情况相似,均有不同程度的降低；小鼠的ALT及AST较正常组有不同程度升高,尤其是AST变化显著；给予高脂饲料饲养的小鼠TG、CHOL均有所升高；但热习服组肝功能及血脂升高不明显。蒿芩清胆汤有降低ALT、AST以及TG、CHOL的作用,清瘟败毒饮有对降低的PLT有提升作用； ④、复合因素造模后,模型组脑组织AQP4的表达增强,胃粘膜AQP2的表达增强；而肾内AQP2的表达减弱；蒿芩清胆汤有逆转上述表达的作用,使之回调,与其余各组相比,差异有统计学意义；并对以上三个AQP进行相关分析,自变量肾AQP2对因变量胃AQP4有显著相关；自变量脑AQP4对因变量胃AQP4无相关关系； ⑤、肝脏病理变化：各造模组均有标本呈不同程度病理变化：肝细胞轻到重度水肿；个别细胞嗜酸性变；肝细胞点状、小灶状坏死,坏死区较多炎细胞浸润；未见脂肪变,未见纤维组织增生。湿热条件干预组小鼠肝脏镜检可见见肝细胞轻度肿胀；蒿芩清胆汤治疗后肝细胞状态有所好转。 3、临床研究：①、湿热疫与暑燥疫患者的年龄分布各有特点,但在年龄、性别、并发肝功能损害情况等方面无差别,而暑燥疫患者在出现高热、合并出现皮疹及血小板降低等方面明显高于湿热疫组；②、两个证型患者中,中西医结合治疗组在平均退热天数、皮疹消退天数、平均住院病程均少于单纯西医治疗组,暑燥疫患者又少于湿热疫患者；③、在血小板复常时间方面,湿热疫组与对照组无显著性差异,而暑燥疫组少于单纯西医治疗对照组和湿热疫组；④、两组患者给予中西医结合治疗后,7天内及7～14天内,其肝功能水平与单纯西药治疗对照组比较无差异。 结论： 1、实验研究结论：综合症状、体温、肝功能损害以及血脂多方面衡量各个模型组,以BALB/c+DV2+热损伤组造模效果,最能体现登革热湿热证的特点；蒿芩清胆汤对以上的登革病毒湿热证模型有治疗作用,能改善症状,下调血脂,保护肝功能改善肝脏病理损害,调整失常的水通道蛋白； 2、临床研究结论：登革热暑燥疫合并高热、出现皮疹及血小板降低的情况明显多于湿热疫,中西医结合治疗登革热在退热、消除皮疹和升高血小板方面的疗效明显优于单纯西药对症治疗,暑燥疫组又优于湿热疫组,但在改善肝功能方面二者尚无差别。