骨髓间充质干细胞治疗新生大鼠缺氧缺血性脑病的体外实验研究

目的：利用体外生物诱导方法研究BMSCs的神经分化能力,免疫荧光技术检测Nestin表达；利用transwell体外迁移模型观察BMSCs向缺氧缺血性脑组织的迁移能力。 方法：参照Rice等和国内吴婉芳等的方法,制作HIBD模型。造模24h后,将大鼠断头处死,剪开颅骨,观察双侧大脑半球的大体形态,然后在冰板上迅速分离患侧大脑半球并立即置于液氮中,之后冻存于-80℃冰箱中备用。取出脑组织,称重,用0.9%预冷到4℃的生理盐水按1：9制备成10%的脑组织匀浆,4℃×3000g×10min离心,留上清。 2周龄SD大鼠4-6只,颈部脱臼处死,无菌条件下取出双侧股骨,剪开两侧干骺端,冲洗骨髓腔,制成单细胞悬液,移入25ml塑料培养瓶中,37℃,5%CO2饱和湿度CO2培养箱中培养,三天后首次换液,去除未贴壁细胞,以后每三天换液一次,倒置相差显微镜下观察细胞达到80%-90%融合时,用0.25%胰蛋白酶消化,按1：3比例传代培养。 待第四代细胞达到90%融合时,取约1×106个细胞悬于100μlPBS中,分别加入适量FITC标记CD29、CD31、CD44、CD45、CD90抗体避光染色30分钟。后用1%多聚甲醛600μl重悬,流式细胞仪进行检测。 选用3-5代的BMSCs进行诱导分化,以5×104／ml密度接种于事先放置涂有多聚赖氨酸盖玻片的六孔板内制备细胞爬片。细胞达80%融合时,将造模24h后HIBD鼠及8日龄正常鼠左脑上清液、右脑上清液与BMSCs共培养。倒置显微镜观察细胞变化。共培养24h后,正常脑组织诱导组、HIBD诱导组、未诱导组盖玻片取出,4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗涤,1%Triton-X-100破膜,PBS洗涤,正常山羊血清室温封闭15 min,加入Nestin抗体(1：100),湿盒4℃冰箱过夜。从冰箱拿出后,室温复温40 min,PBS漂洗3次,加入二抗,山羊抗兔IgG-FITC (1:100)避光孵育30 min,PBS漂洗3次,Depy复染核,甘油封片,阴性对照用PBS取代一抗。荧光显微镜下计算阳性率。 在Transwell上室的聚加入DMEM稀释后Matrigel,合成凝胶碳酸酯膜上。按5×104/cm2密度,配成细胞悬液,接种于上室,只加DMEM,不加FBS,每孔100μl。HIBD组、正常脑组织组、DMEM+FBS组、单纯DMEM组每组10孔,下室中加入各种条件培养基500μl, HIBD组中条件培养基为HIBD脑组织上清液100μl,加入DMEM培养液中配成的含FBS15%培养基；正常脑组织组中由正常脑组织上清液代替HIBD,脑组织上清液；DMEM+FBS组的条件培养基为含15%FBS的DMEM;单纯DMEM组只加DMEM,不加FBS。后置于37℃培养箱中,孵育24h；取出transwell用PBS洗2遍,5%戊二醛固定,4℃；加入苏木素染色,用棉球擦去上表面细胞,显微镜下观察。 结果：细胞接种于培养瓶中后4-6h开始贴壁,10-14d后细胞贴壁细胞达到80-90%融合,1：2比例进行传代,至第三代细胞为成纤维细胞样细胞,胞体细长呈纤维状,细胞核较大,形态为均一的纺锤形。经流式细胞仪检测,大鼠BMSCs表面CD29(99.83%)、CD44(99.77%)、CD90(99.86%)阳性,CD31(0.83%)、CD34(1.78%)、CD45(2.90%)阴性。 BMSCs与脑组织上清液共培养24h后细胞形态逐渐发生变化：原来宽大扁平的长梭形细胞胞体回缩,变圆,后逐渐伸出突起,突起逐渐增多,有些逐渐伸长,类似神经细胞形态。各组细胞进行Nestin免疫荧光染色表明,细胞诱导24h后免疫细胞荧光检HIBD诱导组、正常脑组织诱导组细胞均有Nestin表达,阳性率分别为(31.76±3.56)%、(19.46±2.61)%,未诱导组Nestin阳性率为(2.57±0.73)%,阴性对照组未检测到荧光。HIBD脑组织上清液诱导后细胞表达Nestin阳性率高于正常脑组织上清液诱导组(P<0.01)。 镜下可见不同比例BMSCs向下室迁移情况。单纯DMEM组细胞迁移率(2.69±0.74)%,DMEM+FBS组为(14.91±1.54)%,正常脑组织组为(20.18±4.86)%,HIBD组为(39.42±2.81)%,其中脑损伤24h组向下室迁移细胞最多,与其他各组比较均有统计学意义(P<0.01)。左右脑相比无统计学差异。 结论：大鼠BMSCs可通过直接贴壁法进行体外培养,获得细胞纯度较高,细胞大多呈有序的漩涡状排列。培养过程中偶尔会出现早衰细胞,原因有待进一步探讨。经HIBD脑组织上清液诱导后,BMSCs出现类似神经细胞形态,并表达神经前体细胞的标志蛋白之一Nestin。HIBD脑组织上清液诱导组BMSCs的Nestin阳性率高于正常脑组织诱导组。BMSCs具有向缺氧缺血性脑组织定向迁移的能力,且向HIBD脑组织迁移能力高于正常脑组织(P<0.01)。