高脂喂养大鼠肾脏NF-κB及炎症因子表达变化及利拉鲁肽的干预研究

目的:糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病(DM)常见的慢性并发症,亦是引起终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)的重要原因。其发病机制复杂,近年来发现炎症反应在DN中发挥重要作用。TNF-α及IL-6是主要的炎性标记物,而调控和转录很多炎症因子表达的核转录因子-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)是联系肥胖、炎症的重要机制。DN还存在不同程度的糖脂代谢紊乱,常协同致病,其中也与炎症密不可分。脂质代谢紊乱能诱导细胞产生炎症反应,继而发生胰岛素抵抗(insulin resistance,IR),IR可刺激多种炎性细胞因子释放,加重肾小球肥大,此外,IR带来的高胰岛素血症还可使肾小球血流量增加,肾小球毛细血管静水压升高,处于高灌注状态,进而引起蛋白尿。过多的脂质在肾小球沉积,还可导致肾小球硬化。GLP-1受体激动剂(Glucagon like peptide-1 receptor agonist)利拉鲁肽是目前治疗糖尿病的新药,研究发现该药可改善IR、减轻体重,并可降低糖尿病大鼠尿蛋白、减轻肾小球高滤过和肾脏过度肥大从而改善肾功能,但具体机制不详。本研究通过观察高脂喂养IR大鼠肾功能、尿蛋白、血脂,血清及肾组织中NF-κB、TNF-α及IL-6的表达,探讨糖尿病前期IR阶段肾脏炎症因子的表达变化,及与血脂等的相关性,并用利拉鲁肽干预治疗探讨利拉鲁肽对肾脏炎症进程的影响及机制,为其在糖尿病肾病及其他肾脏疾病中的应用提供理论依据。方法:成年雄性Wistar大鼠54只(230-260g),随机分为对照组(C)普通饲料喂养16只与模型组高脂饲料喂养38只,8周后,各组取5只大鼠行高胰岛素-正常葡萄糖钳夹试验计算葡萄糖输注率(glucose infusion rate,GIR),评价胰岛素抵抗,判定造模成功后,将模型组随机分为高脂组(H)、利拉鲁肽低剂量组(Li-1)(100μg/kg/d)和利拉鲁肽高剂量组(Li-2)(200μg/kg/d),每组11只。前两组用生理盐水皮下注射;后两组分别用利拉鲁肽100μg/kg/d及200μg/kg/d皮下注射。干预2周后,每组再取5只大鼠行钳夹试验计算葡萄糖输注率。每组剩余的6只大鼠用代谢笼收集24 h尿液,后腹主动脉放血处死,取肾脏标本行透射电镜观察肾脏病理结构以及应用Real time-PCR技术测定肾组织NF-κB、TNF-α及IL-6m RNA表达,自动生化分析仪检测血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、总胆固醇(TCH)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),免疫比浊法测定24h尿微量白蛋白(MAU),Elisa法测定血清NF-κB、TNF-α及IL-6蛋白浓度。结果:1.四组大鼠一般情况比较与对照组相比,高脂组大鼠Scr、BUN、MAU、TCH、TG、LDL-C均明显升高(P<0.05);与高脂组相比,利拉鲁肽低剂量组大鼠Scr、BUN、MAU、TG、LDL-C均降低(P<0.05),利拉鲁肽高剂量组大鼠Scr、BUN、MAU、TCH、TG、LDL-C明显降低(P<0.05);与利拉鲁肽低剂量组相比,利拉鲁肽高剂量组Scr、BUN、MAU、TG、LDL-C进一步降低(P<0.05)。2.四组大鼠葡萄糖输注率比较药物干预前:与对照组GIR(30.21±2.51mg/kg.min)相比,高脂组GIR(20.41±3.64mg/kg.min)下降,差异有统计学意义(P<0.05)。利拉鲁肽干预2周后:与对照组GIR(30.77±2.37mg/kg.min)相比,高脂组GIR(18.83±1.95 mg/kg.min)下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与高脂组相比,利拉鲁肽低剂量组GIR(21.55±2.46mg/kg.min)升高(P<0.05),与低剂量组相比,利拉鲁肽高剂量组GIR(25.80±1.40mg/kg.min)进一步升高,差异均有统计学意义(P<0.05)3.四组大鼠血清NF-κB、TNF-α和IL-6蛋白浓度的比较与对照组相比,高脂组血清NF-κB、TNF-α和IL-6蛋白浓度均升高(P<0.05);与高脂组相比,利拉鲁肽干预组NF-κB、TNF-α和IL-6蛋白浓度均降低(P<0.05);且利拉鲁肽高剂量组比利拉鲁肽低剂量组,NF-κB、TNF-α和IL-6蛋白浓度进一步降低(P<0.05)。4.四组大鼠肾脏组织NF-κB、TNF-α和IL-6 m RNA的比较与对照组相比,高脂组肾脏组织NF-κB、TNF-α和IL-6 m RNA的表达均升高(P<0.05);与高脂组相比,利拉鲁肽干预后肾脏组织NF-κB、TNF-α和IL-6 m RNA的表达均降低(P<0.05);利拉鲁肽高剂量组与利拉鲁肽低剂量组相比,肾脏组织NF-κB、TNF-α和IL-6 m RNA的表达进一步降低(P<0.05)。5.四组大鼠肾脏组织电镜超微结构比较透射电镜结果显示(放大10000倍):对照组大鼠肾小球结构完整,基底膜(GBM)清晰,足突分布整齐、间隙明显;高脂组大鼠肾小球足突肿胀,部分融合、脱落,基底膜增厚;利拉鲁肽干预可改善上述改变,尤以利拉鲁肽高剂量组明显。6.相关性分析研究结果血清TNF-α和IL-6蛋白浓度与MAU呈正相关(r值=0.802、0.748,P<0.05);肾组织TNF-αm RNA表达与TCH、TG呈明显的正相关(r值分别为0.878、0.817,P<0.05);肾组织IL-6 m RNA表达与TCH、TG呈明显正相关(r值分别为0.806、0.854,P<0.05);肾组织NF-κB m RNA表达与TNF-α和IL-6 m RNA表达呈正相关(r值分别为0.810、0.867,P<0.05)。结论:1高脂饮食可使大鼠发生脂代谢紊乱及胰岛素抵抗,并可通过增加肾脏NF-κB和炎症因子TNF-α和IL-6表达激活炎症反应,增加微量白蛋白尿,加重肾损伤。2利拉鲁肽可呈剂量依赖性减轻脂代谢紊乱,改善胰岛素抵抗,减少微量白蛋白尿,保护肾功能。3利拉鲁肽可呈剂量依赖性抑制肾脏NF-κB表达,下调肾组织炎症因子TNF-α和IL-6表达,改善肾功能。