黄芪总皂苷体外抗柯萨奇病毒及对小鼠免疫功能影响的初步研究

本课题通过对黄芪皂苷类成分提取纯化工艺进行优化,建立高效、稳定的皂苷类提取、纯化工艺,对皂苷类成分体外抗病毒（柯萨奇B5）情况进行研究,对小鼠的免疫能力的影响进行初步探讨。研究内容包括:1.通过对黄芪提取溶剂的选择,同时建立测定黄芪中总皂苷、黄芪甲苷成分含量的测定方法,建立方法稳定可靠,能够对本次实验黄芪中总皂苷及黄芪甲苷的含量进行测定;最终选定本课题的提取溶剂为水。2.通过正交试验的方法,确定黄芪提取工艺为加水煎煮2次,第一次加9倍量水,煎煮2小时,第二次加7倍量水,煎煮1小时;纯化工艺采用磷酸氢二钾-无水乙醇双水相体系,对黄芪中的总皂苷进行纯化;最后采用聚酰胺柱对黄芪中总皂苷类成分进行分离,聚酰胺活化后每100ml上2.5g原药（湿法装柱湿法上样）,活化1h,用3BV的水、25%乙醇溶液、50%乙醇溶液进行洗脱,洗脱速度为1.0BV/h。结果药材经过提取纯化工艺后,以黄芪甲苷为主要参考指标,黄芪甲苷的总转移率为77.1%总皂苷的转移率为73.3%,其中双水相纯化后的黄芪甲苷的转移率为83.77%黄芪总苷的转移率为84.32%,黄芪经双水相纯化后总皂苷纯度为46.02%。经聚酰胺柱后黄芪甲苷的转移率为92.05%黄芪总皂苷的转移率为87.00%。经过聚酰胺纯化分离后总皂苷的纯度为87.20%。3.引入“一测多评”法,以黄芪甲苷为内参物,建立黄芪皂苷类有效部位质量标准的制定,计算各成分的变量系数,通过计算相对保留值和结果数据与外标法结果进行对比,结果表明所建立的HPLC含量测定方法简单可靠,能够对黄芪中黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅳ（黄芪甲苷）以及异黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅱ的含量进行同时测定。应用“一测多评”法对黄芪中各皂苷成分进行测定发现相对保留值的RSD偏高,但计算含量数据与外标法无差异性。按照中国药典一部2015年版对黄芪中黄芪甲苷的要求,要求黄芪按干燥品计算,含黄芪甲苷（C41H68O14）不得少于0.040%。因此含黄芪皂苷Ⅰ不得少于0.031%、黄芪皂苷Ⅱ不得少于0.032%、黄芪皂苷Ⅲ不得少于0.014%、异黄芪皂苷Ⅰ不得少于0.022%、异黄芪皂苷Ⅱ不得少于0.024%。4.探究原药、黄芪总皂苷成分（50%醇洗脱）、聚酰胺水流出成分对小鼠免疫功能的影响。结果为黄芪能够显著的提高小鼠机体的免疫能力,能够促进小鼠体内免疫器官的增长及细胞因子的含量的。表明黄芪皂苷类成分能够促进小鼠的免疫能力。5.对原药、黄芪总皂苷成分（50%醇洗脱组）、聚酰胺水洗脱成分进行体外抗病毒研究,结果表明在体外抗病毒实验中原药与黄芪总皂苷成分抗病毒效果明显,在四项实验中对细胞的保护作用及抗病毒吸附作用的效果要优于细胞增殖、直接抗病毒作用。实验结果能够证实黄芪皂苷类成分体外抗柯萨奇（B5）病毒作用。