腐生与共生食用菌菌丝体分离、培养及其DNA鉴定研究

无论是食用菌的人工栽培，还是珍贵野生蘑菇的驯化研究，都需要制备菌种并对菌种的真伪进行鉴定，其中最可靠的鉴定方法是诱导纯培养菌种产生赖以识别的子实体。常见食用菌如香菇、平菇的菌种，均可用出菇试验鉴定真伪，但费工费时。尚未驯化的珍贵食用菌如松口蘑、美味牛肝菌等，目前无法诱导人工纯培养菌种出菇，亟待寻找新的可靠办法鉴定分离菌株的真伪。本文首先采用随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polyrnorphic DNA，RAPD)指纹比对技术，对香菇Lentinulaedodes(Berk)Pegler、平菇Pleurotus ostreatus(Jacq：Fr)Quel的分离菌种进行DNA鉴定，取得了和出菇试验一致的鉴定结果。然后进一步采用DNA指纹比对技术，对著名的野生共生食用菌松口蘑Tricholoma matsutake(S.Ito et Imai)Sing、牛肝菌Suillus granulatus(Fr)Kuntze、大红菇Russula rubra(Krom)Bres．等的各种人工分离菌株进行了DNA鉴定，并对它们的菌丝体分离，培养方法进行了探讨。现将研究结果摘要报告如下： 1．香菇分离菌株的DNA鉴定。首先利用常规组织分离方法取得了不同来源香菇子实体的菌丝体纯培养，然后利用代料栽培方法进行出菇试验肯定了分离菌株的真实性。接着以12个随机引物介导RAPD-PCR试验，对香菇子实体不同组织与分离菌株进行DNA指纹比对，发现相同子实体的不同组织即菌盖、菌褶、菌柄，都具有相同的DNA指纹图谱，证明一个子实体内遗传物质DNA的同质性(homogeneity)。从子实体组织分离获得的菌丝体菌株与其来源子实体的不同组织，全部具有相同的DNA指纹图谱，显示了分离菌株与子实体是相同的基因克隆产物，明确判定分离菌株是香菇菌丝体纯培养物。试验结果还表明：人工栽培产生的子实体及其组织分离菌丝体，与所用栽培菌种茵丝体及其种源子实体，都具有一致的RAPD指纹图谱：而不同来源的子实体之间的DNA相似系数在0.886～0.986之间。 2．平菇分离菌株的DNA鉴定。试验从不同栽培场所采集到白色、灰色与黑色不同颜色的平菇子实体，分别取菌柄进行组织分离，均获得了菌丝体分离菌株。采用12个RAPD随机引物介导PCR试验，对获得的所有DNA指纹图谱进行比对分 ，东方博士论文:腐生与共生食用菌菌丝体分离、培养及其ONA鉴定研究 析，发现不同颜色的平菇子实体之间存在着DNA差异，统计分析表明不同来源平 菇的遗传相似系数在0.779～0.976之间，其中两个灰色平菇在0.976相似水平上聚类， 而与白色平菇在0.955水平上聚类，再与黑色平菇在0.779水平上聚类.试验还表 明，不同颜色的平菇都具有相同的遗传规律，即一个相同的平菇子实体上的不同组 织，包括菌盖、菌褶、菌柄，均具有相同的DNA指纹图谱.试验组织分离的菌丝 体依次与其来源子实体的DNA指纹图谱对应相同，依此判定平菇分离菌株是平菇 菌丝体纯培养物. 3.珍稀共生食用菌松口蘑植被调查研究。试验对我国东北长白山的余脉，吉林 省龙井市内的一座松茸山进行了植被调查，分类记载植物38科74种，大型真菌8 科巧种，共计46科89种。除了常见的赤松(尸inusde胭必ra)、蒙古栋(Que兀es m口吧口lica)、胡枝子(众印‘beza bicolor)、兴安杜鹃(Rhododen动侧nc加”anthum) 等外，另外以前并未报道的22种植物，3种高等真菌也在松茸蘑菇圈附近出现频率 很高，例如被当地菇农称为松茸花的山萝花(Mela州眨”似脚roseum)，与松茸同期发 生的蘑菇如密丛枝(R amaria stricta)、粘柄丝膜菌(cortinari。。口llinitus)等. 4.野生松口蘑DNA多态性研究。利用RAPD分析技术研究了我国主产区野生 松口蘑的DNA指纹图谱.从40个随机引物中筛选到18个扩增效果好，重复性稳 定的引物以介导不同来源的20个松茸子实体DNA的扩增，得到了它们清晰可辨的 DNA指纹。分子数据分析把供试松茸在72%相似水平上聚成一类，支持云南、四 川、吉林的松茸是一个相同物种的结论。鉴于目前松茸菌丝体分离培养困难，制备 松茸子实体的DNA指纹图谱，为鉴定不同生境下获得的组织分离物之真伪提供了 遗传依据。 5.松口蘑菌丝体分离培养。试验采用8种培养基配方，对9个松口蘑子实体 的不同部位进行组织分离，计接种试管810支。结果从菌褶部位获得94支慢生型 的菌丝体分离菌株，从菌柄部位仅获得1支快生型的分离菌株.除51支试管污染 细菌型菌落、8支试管污染霉菌以外，其余656支各种培养基的试管未长任何微生 物菌落。试验结果表明，松茸菌丝体分离的适宜组织部位是新鲜松口蘑的菌褶，而 以前报道的菌柄并不适合作为菌丝体分离。在供试8种培养基中，以马铃薯葡萄糖 土壤滤液培养基(PDAS)为最适用，对菌褶进行组织分离的成功率达74.4%。另 外，马铃薯葡萄糖麦数滤汁培养基(PDAW)、BM培养基、PDA培养基也从菌褶 2 曾东方博士论文:腐生与共生食用菌菌丝体分离、培养及其DNA鉴定研究 分离到松茸菌丝体，分离成功率依次是35.5%、巧.6%和8.9%。试验还对松茸菌根、 带菌丝土壤进行了分离，结果很容易获得各种快生型的丝状真菌，因此认为菌根、 土壤并不适合分离松口蘑菌丝体。 6.松口蘑分离菌株的DNA鉴定。试验以9个吉林松口蘑子实