研究背景
茜草科(Rubiaceae)钩藤植物是常用中药,被《中华人民共和国药典》2010年版收载,其中正品钩藤包括：钩藤Uncaria rhynchophylla (Miq) Miq. ex Havil.、大叶钩藤Uncaria macrophylla Wall.、毛钩藤Uncaria hirsute Havil.、华钩藤Uncaria sinensis (Oliv.) Havil.、无柄果钩藤Uncaria sessilifructus Roxb.。其药用历史可追溯到魏晋时期,《名医别录》、《本草纲目》、《药性论》等古籍均有记载。钩藤味甘,性凉,归肝、心包经,具有息风定惊、清热平肝的功效。主治肝风内动,惊痫抽搐,高热惊厥,感冒夹惊,小儿惊啼,妊娠子痫,头痛眩晕,多以复方入药。现代主要用于治疗原发性及继发性高血压、脑神经性疾病及脑血管疾病,还可用于治疗癫痫、老年期痴呆和防治药物依赖。
钩藤碱(Rhynchophylline, Rhy)是钩藤中含量最高的吲哚类生物碱,占总生物碱的20-30%,其他生物碱还包括异钩藤碱、柯诺辛碱、柯诺辛碱B、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱及柯楠因碱等。现代药理研究表明钩藤碱主要作用于心血管和中枢神经系统,不仅在高血压、心律失常、心肌肥大、血栓等方面具有疗效；而且在脑缺血再灌注损伤、阿尔茨海默病、癫痫、惊厥、焦虑症、药物依赖方面也具有神经保护作用。其作用机制与抑制L-钙通道和钾通道,拮抗NMDA受体和AMPA受体,调节谷氨酸、多巴胺、去甲肾上腺素、乙酰胆碱、内啡肽、5-羟色胺等中枢神经递质的代谢有关。
NMDA受体是与Ca2+通道偶联的离子型兴奋性氨基酸受体。天然的NMDA受体由NRl、NR2和NR3三种亚基组成的异聚体。其中NR2又分为NR2A、NR2B、NR2C和NR2D4个亚型。NRl是基本的功能单位,NR2决定受体的性质,NR3在NMDA受体中主要发挥抑制作用。NMDA受体广泛分布于脑、脊髓和外周组织。NMDA受体拮抗剂分为竞争性和非竞争性拮抗剂两类。竞争性NMDA受体拮抗剂作用于兴奋性氨基酸的识别位点,如AP5、AP7、CPP等。非竞争性NMDA受体拮抗剂作用于离子通道,如MK-801、氯胺酮、PCP等。非选择性的NMDA受体拮抗剂存在严重的不良反应,包括拟精神病药作用和对运动功能的影响。NR2B选择性拮抗剂,如：艾芬地尔、依利罗地、氟哌啶醇、苯丙氨酯具有神经保护、抗惊厥、镇痛等作用。NMDA受体的激活可以触发长时程增强和长时程抑制,是大脑学习、记忆、认知、突触可塑性的生理机制。但是,NMDA受体的过度激活也可引发多种中枢神经系统疾病,如脑中风、帕金森病、阿尔茨海默病、癫痫、亨廷顿舞蹈病、精神分裂症等。
有文献报道,钩藤的水提物具有抗焦虑作用。本课题组前期进行的钩藤碱药效学实验表明,钩藤碱(60mg/kg)增加小鼠在5分钟内进入开臂次数和延长在开臂滞留的时间,增加10分钟内的穿箱次数和延长在明箱滞留的时间,证实钩藤碱确有抗焦虑的功效。但是,钩藤碱抗焦虑作用的机制仍未明确。前期研究发现钩藤碱抑制苯丙胺诱导的条件性位置偏爱大鼠杏仁核和伏核中NR2BmRNA和蛋白的表达,且钩藤碱本身无精神依赖作用。还发现钩藤碱抑制NMDA受体钙通道的激活,降低甲基苯丙胺引起的原代皮质神经元胞内的钙超载,具有神经保护作用,提示钩藤碱可能是NMDA受体抑制剂。我们推测,钩藤碱抗焦虑作用可能与NMDA受体有关。
研究目的
钩藤碱不仅在高血压、心律失常、心肌肥大、血栓等心血管方面具有疗效；而且在脑缺血再灌注损伤、阿尔茨海默病、癫痫、惊厥、焦虑症、药物依赖等神经系统方面具有保护作用。的钩藤碱药效学预实验证实,钩藤碱具有抗焦虑的作用,但机制尚未明确。药物依赖的药理学实验表明,钩藤碱可能是NMDA受体抑制剂。钩藤碱是否通过调节NMDA受体发挥抗焦虑效应是本文关注的重点。鉴于以上分析,在本课题组前期研究的基础上,本文以原代培养的新生鼠海马神经元为研究对象,从定位、定量、定性三个角度观察钩藤碱对NMDA受体NRl、NR2B亚基的影响。
实验方法
1.原代海马神经元模型的建立和鉴定：取24h内的SD新生鼠,急性处死,钝性分离左右海马,剥去脑膜,剪成粥糜状,用0.125%胰酶于37℃消化30min,终止消化后,轻轻吹打至组织块消失。所有操作在冰上进行。将细胞悬液过200目筛网,离心。种植培养基调整密度为5×105个/ml,按2ml/孔接种于6孔板中。37℃,5%C02孵箱中孵育。12h内换维持培养基,以后每4天半量换液。倒置显微镜下观察神经元的生长情况。神经元特异性烯醇化酶鉴定。在显微镜下观察,随机选取五个视野,计数每个视野中阳性细胞数,计算海马神经元平均纯度。
2.NRl和NR2B亚基在神经元上的共定位表达：将原代的海马神经元以5×105个/ml的密度接种于预包被的小玻片上,待生长至第8天时,取形态良好的细胞用于后续的实验。用免疫荧光双标法对细胞进行染色,一抗为兔抗大鼠NR1和小鼠抗大鼠NR2B,二抗为FITC-羊抗兔和CY5-羊抗小鼠,DAPI染核。激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
3.MTT法分别检测钩藤碱和MK-801的神经毒性：根据钩藤碱和MK-801的测试浓度,将生长至6天的原代神经元分为8组,即空白对照组、正常对照组、50μmol/L组、100μmol/L组、200μmol/L组、400μmol/L组、800gmol/L组、1000μmol/L组。以1×106个/ml的密度接种于预包被的96孔板内,每组6个复孔,每孔接种100μl,空白对照组不接种细胞,以100μl培养基替代。将1mmol/L钩藤碱和MK-801母液稀释成50μmol/L、100μtmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L、1000μmol/L,每孔加入相应浓度的含药维持培养基100μl,空白对照组和正常对照组每孔加入100μl新鲜的维持培养基。37℃、5%C02孵育48h。按照MTT实验步骤,分别检测钩藤碱和MK-801处理后神经元的活力,用酶标仪在490nm波长下测定光密度值,重复3次实验。所有数据以均数±标准差(x±s)表示,用SPSS13.0软件进行统计分析,组间比较采用单因素方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA),以P<0.05为差异具有统计学意义。
4.钩藤碱对NRl和NR2B mRNA表达的影响：将新生鼠原代海马神经元以1×106个/ml接种于预包被的6孔板内,6天后,将细胞分为正常对照组、MK-801200μmol/L组、钩藤碱100μmol/L组、钩藤碱200pmol/L组、钩藤碱400μmol/L组。将1mmol/L MK-801母液稀释成200μmol/L,1mmol/L钩藤碱母液分别稀释为100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L。正常对照组给予新鲜维持培养基2ml/孔,其余各组给予相应浓度的含药培养基2ml/孔,37℃、5%CO2分别孵育6h和48h。采用Real-time PCR技术检测各组NR1和NR2B mRNA的表达。每组3个复孔,重复3次实验。所有数据以x±s表示,用SPSS13.0软件进行统计分析,组间比较采用单因素方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA),以P<0.05为差异具有统计学意义。
5.钩藤碱对NRl和NR2B蛋白表达的影响：将新生鼠原代海马神经元以5×105个/ml接种于放有预包被小玻片的6孔板内,6天后,将细胞分为正常对照组、MK-801200μmol/L组、钩藤碱400μmol/L组,每组3个复孔。将1mmol/LMK-801母液稀释成200μmol/L,1mmol/L钩藤碱母液稀释为400μmol/L。正常对照组给予新鲜维持培养基2ml/孔,其余各组给予相应浓度的含药培养基2ml/孔,37℃、5%C02分别孵育48h。按照免疫荧光双标法的操作步骤,进行细胞染色。一抗为兔抗大鼠NR1和小鼠抗大鼠NR2B,二抗为FITC-羊抗兔和CY5-羊抗小鼠,DAPI染核。激光共聚焦显微镜下观察并拍照,拍照时保持每张片子的仪器参数一致。IPP5.1软件对细胞进行荧光强度分析,分别计算单个神经元FITC、CY5和DAPI的平均荧光强度。
实验结果
1.神经元形态观察、鉴定和纯度计算：神经元接种6-8d后,胞体较大,呈三角形、圆形或椭圆形,透光性强,周边有光晕。神经元突起增长增粗,交织成网状,细胞完全成熟,可用于实验。14d后,杂细胞增多,细胞慢慢老化。神经元特异性烯醇化酶鉴定细胞为阳性。经计算,神经元纯度最低值为85.9%,最高值为97.5%,平均纯度为(92.6±4.62)%。胰酶消化法结合无血清培养能成功建立原代海马神经元模型,6-8d的神经元形态和纯度均达到实验要求。
2.NRl和NR2B在神经元上的共定位：NRl主要分布于神经元的轴突和树突干及近突起的胞质内和胞膜上；NR2B分布于胞体膜、轴突和树突膜上,在神经元的郎飞结和突触末端有高密度分布。NRl和NR2B在突触末端、树突干、树突棘共定位表达,表明NR1和NR2B可能与离子流动、神经冲动的传导、递质的调节有关。
3.钩藤碱和MK-801的神经毒性：钩藤碱和MK-801的OD-C曲线均呈现“反S”形。钩藤碱400μmol/L以下处于平台期,对神经元的活力无影响；400-1000μmol/L处于斜线期,随着浓度的增大,钩藤碱的神经毒性也逐渐增大；大于1000μmol/L处于平台期,钩藤碱对神经毒性不随浓度增大而增大。MK-801在200μmol/L以下处于平台期,对神经元活力无影响：200～800μmol/L处于斜线期,MK-801的神经毒性随浓度增大而增大；大于800μmol/L处于平台期,MK-801的神经毒性不随浓度的增大而增大。钩藤碱各浓度OD值比MK-801高,表明钩藤碱毒性要比MK-801小。筛选出钩藤碱的安全实验浓度为100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L,MK-801的浓度为200μmol/L。
4.钩藤碱对NR1和NR2B mRNA的表达：MK-801作用6h后,MK-801下调NRl和NR2B mRNA的表达；作用48h后,MK-801上调NRl和NR2BmRNA的表达。钩藤碱作用6h,钩藤碱低、中、高剂量组NR1mRNA增高,对NR2B mRNA表达没有影响：作用48h后,钩藤碱低、中、高剂量组上调NR1mRNA的表达,下调NR2B mRNA表达。MK-801对NRl和NR2B mRNA的表达随时间变化呈先降后升的趋势。钩藤碱对NR1mRNA的表达均呈现持续上升趋势,对NR2B mRNA的表达呈下降趋势。钩藤碱可能选择性抑制NR2B的表达。
5.钩藤碱对NR1和NR2B蛋白表达的影响：药物处理48h后,与正常组相比,钩藤碱增强神经核周围的NRl蛋白表达,对胞膜上NRl影响不明显,降低树突上NR2B的膜表达;MK-801明显增强神经核周围NRl的蛋白表达,并呈点状分布,树突棘上NR2B表达增高。
结论
1.胰酶消化法结合无血清培养能获得纯度较高、稳定可靠的神经元模型。
2.NR1分布于神经元轴突、树突干和突起端的胞质内和胞膜上,NR2B分布于神经细胞膜、轴突膜、树突膜上,在神经元的突触末端、树突棘和郎飞结有高密度分布。
3.钩藤碱在低浓度下具有神经保护,最大安全浓度为400μmol/L,随着浓度的增加,细胞毒性增加,大于1000μmol/L,细胞活力降到最低值；MK-801在低浓度下对神经元无影响,最大安全浓度为200μmol/L,随着浓度的增加,细胞毒性增加,1000μmol/L细胞活力降到最低值。
4.钩藤碱上调NR1mRNA的表达,具有浓度依赖性和时间依赖性；下调NR2B的mRNA表达,具有时间依赖性,但不具有浓度依赖性。钩藤碱对NR2B具有选择性抑制作用。
5.钩藤碱上调神经细胞核周围NR1蛋白表达,下调树突干、树突棘和轴突上NR2B的蛋白表达,树突干、树突棘和突触末端膜上NR1/NR2B受体族数量减少,表明钩藤碱可能是一个选择性的非竞争性NMDA受体抑制剂。钩藤碱对NMDA受体的选择性抑制作用可能是其抗焦虑作用的机制之一。
