microRNA对冠心病疑似致病基因LPPR4表达调控的初步研究

研究背景冠状动脉性心脏病简称冠心病(Coronary Artery Disease,CAD)在全世界范围造成严重的医疗和经济负担。男性发病年龄在55岁之前,女性在65岁之前的CAD称为早发冠心病(EarlyOnsetCoronary Artery Disease,EOCAD),遗传因素在 EOCAD发病中起到的作用尤为突出。我们收集了一个呈常染色体显性遗传的汉族早发冠心病家系,前期工作中通过全外显子组测序定位了 LPPR4基因3'UTR区单碱基缺失突变可能是该家系的致病基因,并发现该突变导致了 LPPR4蛋白表达下调。考虑到3'UTR区转录后表达调控与microRNA的关系,为了探究本家系患者早发冠心病的病理机制,需首先探明LPPR4基因表达是否通过miRNA进行调控。通过靶点预测网站检索发现候选变异正好位于miR-450a的识别位点中,此外既往文献报道miR-103a及miR-155-5p与冠心病密切相关,我们通过miRNA-DNA的靶效关系分析它们有可能与LPPR4 3'UTR区产生作用。研究目的了解目标3种miRNA与LPPR4基因蛋白表达及生理表型关系,明确目标miRNA是否与LPPR4基因3'UTR片段发生相互作用,初探后续调控表达相关机制。研究方法考虑到miRNA的效应与其在细胞内的表达丰度密切相关,首先行qPCR测定目标3种miRNA在包括血管平滑肌细胞在内的两种细胞系内的基线丰度。之后行干预实验,通过转染miRNA mimics后测定LPPR4蛋白表达量变化,以及行transwell试验测定细胞迁移变化,证实目标miRNA确与LPPR4表达调控相关。随后建立含有野生/突变型LPPR4 3'UTR区突变位点序列的荧光报告基因检测质粒,通过luciferase实验证明目标miRNA是通过与LPPR4基因3'UTR区前80位碱基序列结合而发挥起调控作用的。最后利用RNA聚合酶Ⅱ强抑制剂放线菌素D对细胞进行预处理抑制细胞转录,随即转染miRNAmimics,在不同时间点裂解细胞,行qPCR测定LPPR4 mRNA水平随时间推移的变化,以确定miRNA与LPPR4基因3'UTR区结合后是否通过影响mRNA稳定性实现调控。研究结果qPCR结果显示三种miRNA中miR-103a相对丰度最高。在miRNA干预实验中转染了 miR-103a及miR-450-5pmimics,行蛋白免疫印迹及transwell试验示高水平miR-450-5p对LPPR4基因的表达可能起下调作用,而miR-103a对LPPR4基因的表达可能起上调作用。双荧光素酶实验表明这两种miRNA与3'UTR区的确产生了相互作用,后续mRNA稳定性实验中miR-103a组LPPR4 mRNA降解率较对照组出现了下调,而miR-450-5p组和对照组间未发现显著差异。研究结论1.高水平miR-103a会上调LPPR4蛋白表达,并抑制血管平滑肌细胞的迁移;而miR-450-5p则下调LPPR4蛋白表达,并促进血管平滑肌细胞发生迁移。2.miR-450-5p及miR-103a均与LPPR4基因3'UTR区前80碱基序列存在相互作用。3.miR-450-5p与LPPR4基因mRNA稳定性调控相关。