毛囊干细胞向上皮细胞分化及其相关调控信号的初步研究

第一部分小鼠鼠须及人头皮毛囊干细胞的定位及特点 目的明确小鼠鼠须垫毛囊及成年男性额部毛囊干细胞的定位及分布特点，筛选鼠须垫切片快速高效的方法，比较正常成年男性与脂溢性脱发成年男性额部毛囊干细胞数量差别。 方法取8周龄BALB／C小鼠双侧鼠须垫，自制标本固定器脱水，包埋切片，作常规HE染色及角蛋白15(CK15)免疫组化；取正常成年男性及脂溢性脱发成年男性额部头皮，脱水包埋切片，并作常规HE染色及角蛋白15免疫组化，显微镜下分析结果并比较。 结果在显微镜下：①HE染色及CK15免疫组化能明确显示小鼠(BALB／C)鼠须垫毛囊毛囊外根鞘(ORS)、内跟鞘(IRS)、毛乳头(FP)及毛干(HS)及立毛肌等结构。在毛囊立毛肌止点外根鞘隆起的部位小范围角蛋白CK15表达明显。②HE染色及CK15免疫组化能明确显示成年男性额部头皮毛囊外根鞘、内跟鞘、毛乳头、皮脂腺、毛干及立毛肌等结构。但与小鼠不同，成年男性额部头皮毛囊CK15表达自皮脂腺开口水平以下的外根鞘狭长区域延展至中部，逐渐变淡。额部毛囊干细胞数量正常成年男性高于脂溢性脱发成年男性(P＜0.05)。 结论小鼠鼠须毛囊干细胞位于毛囊立毛肌止点附近的隆突内，人头皮毛囊干细胞位于毛囊皮脂腺开口水平以下狭长区域的外根鞘内，并且额部毛囊干细胞数量正常成年男性高于脂溢性脱发成年男性。 第二部分小鼠鼠须毛囊干细胞向短暂增殖细胞(TA细胞)分化的研究 目的研究小鼠鼠须毛囊干细胞在外源性表皮生长因子(EGF)及创伤的诱导下，向TA细胞分化的情况。 方法将8周龄BALB／C小鼠随机分4组，双侧鼠须垫去表皮，每天经口内颊粘膜注射EGF，分别为OIU，1000IU，5000IU，10000IU，观察创面恢复情况，确定最佳干预剂量。 将8周龄BALB／C小鼠随机分三组，分别记为EGF组、创伤组和空白组。EGF干预采用每天经口内颊粘膜注射法(剂量5000IU)，创伤采用鼠须垫去表皮法。①分别于D0、D1、D3、D5、D7、D9(D-天)收集鼠须垫标本，脱水固定，做CK15及CK14免疫组化，CK15及CK14阳性细胞计数，方差分析不同组别不同时间有无差别。②取三组D0、D1、D3、D5、D7、D9小鼠鼠须垫，提取其毛囊真皮鞘细胞，FACS分析其CK15及CK14阳性细胞比率变化。 结果三种剂量EGF均加速伤口愈合，OIUEGF组创面愈合时间为9天，1000IUEGF组为8天，5000IUEGF及10000IU组没有差别，均为7天。确定每天一次给予5000IU EGF为后续实验干预剂量。 免疫组化结果：①CK15阳性细胞聚集于隆突部，与第一部分实验结果一致：a同组别不同时点比较，EGF组在不同时点CK15阳性细胞数目差别显著。第1天比第0天明显减少，第3天比第1天明显减少，第5天比第3天明显减少，第7天比第5天明显减少，第9天比第7天明显减少(均为P＜0.05)；创伤组在不同时间点CK15阳性细胞数目也呈现类似的变化，CK15阳性细胞渐次减少(均为P＜0.05)；空白组在不同时间CK15阳性细胞数目无明显变化(P＞0.05)。b同时点不同组别比较，在第0天时各组CK15阳性细胞数目无显著差别(P＞0.05)，在第1天，EGF组及创伤组与空白组都有明显差别(P＜0.05)，但两者之间无显著差别(P＞0.05)。第3，5，7，9天不同组别CK15阳性细胞数目差别显著，均为第空白组最多，其次为创伤组，EGF组组最少(均为P＜0.05)。②CK14阳性细胞分布范围则明显广于CK15阳性细胞，毛囊外根鞘及皮下组织均可见广泛表达：a同组别不同时点比较，EGF组在不同时点CK14阳性细胞数目差别显著。第1天比第0天明显增多，第1到7天缓慢增多，第9天比第7天又明显增多(均为P＜0.05)；创伤组在不同时间CK14阳性细胞细胞数目也不同，增多速度比较平缓；空白组在不同时间CK14阳性细胞数目无明显变化(P＞0.05)。b同时点不同组别比较，在第0天时各组CK14阳性细胞数目无显著差别(P＞0.05)，第1，3，5，7，9天不同组别CK14阳性细胞数目差别显著，均为空白组最少，其次为创伤组，EGF组最多(均为P＜0.05)。 流式细胞分析结果：分析显示EGF组、创伤组CK15阳性细胞比率从第1天开始就明显下降，且下降速率前者大于后者，空白组没有明显变化。EGF组、创伤组CK14阳性细胞比率逐渐增加，且前者大于后者，空白组没有明显变化。 结论①外源性EGF能加速小鼠创面的愈合，每天给予5000IU能显著加速创面的愈合。 ②EGF与创伤均能启动小鼠鼠须毛囊干细胞向TA细胞分化。EGF能加速创面的愈合，这种作用在干预的前期效果明显，随着时间的推移，作用减弱。 第三部分EGF干预下小鼠鼠须毛囊外根鞘Notch信号变化的研究 目的研究在外源性EGF及创伤的刺激下，小鼠毛囊外根鞘细胞中Notch信号的相关组分变化情况及信号的活化情况。 方法将8周龄BALB／C小鼠均分三组，分别为EGF组、创伤组和空白组。EGF干预采用每天间断经口内颊粘膜注射法，创伤采用鼠须垫去表皮法。分别于D0、D1、D3、D5(D-天)收集鼠须垫标本，分离毛囊外根鞘，制成单细胞悬液，抽取mRNA，逆转录成cDNA，RT-PCR分别做Notchl、Delta、EGFR、及Notch信号的活化成分ICN基因测试，并比较各组有无差别。 结果①各组细胞均能检测到Notchl、Delta、EGFR基因，且条带半定量分析基本相同，无明显区别(P＞0.05)。②EGF干预组在第1天能检测到ICN条带，灰度较淡。第1，3，5天均未测得。另外两组标本均未能测得ICN条带。 结论①在外源性EGF刺激下，小鼠鼠须毛囊外根鞘细胞Notch信号被激活，且早期明显。提示EGF通过Notch信号途径促进创面的愈合。 ②创伤刺激未能激活Notch信号。 第四部分人自体毛囊移植治疗慢性大面积创面的研究 目的探索用自体毛囊移植治疗慢性大面积创面的可能性。 方法选择慢性难治性大面积创面病例，患者知情同意，创面清创，控制感染至新鲜肉芽组织无脓性渗液。枕后备皮，英国刀取刃厚皮，修剪成0.5cm×0.5cm邮票状；切取取皮区毛囊，显微镜下单根分离约400根，形成去表皮毛囊。创面纵行分为两区：毛囊种植区及刃厚植皮区。凡士林油纱布覆盖，抗生素生理盐水纱布包扎，患肢制动。定期换药，观察两区创面愈合情况；取活检，HE常规染色，免疫组化检测CK广谱、vimentin(弹性蛋白)表达，观察新生皮肤情况。 结果①大体观察术后2周：毛囊种植区可以看到苍白色新生上皮由移植毛囊向外长出，以移植毛囊为中心成鹅卵石皮岛样分布；刃厚植皮区植皮成活，但生长较慢。术后8周：毛囊种植区新生皮肤连接成片，色泽基本一致，并有部分新生汗毛样纤细毛发长出；刃厚植皮区瘢痕化明显，皮肤色泽不均。术后10周：毛囊种植区新生皮肤逐渐成熟，成暗红色，能耐受一定程度摩擦；刃厚植皮区瘢痕化明显，凹凸不平。术后4月：毛囊种植区新生皮肤成熟，颜色质地均匀，并有纤细汗毛样毛发生长；刃厚植皮区则瘢痕明显，质地较差。②免疫组化毛囊种植区2周始新生表皮由毛囊延伸长出，CK广谱表达较高，并出现表皮与真皮间的钉突结构(rete ridges)，刃厚植皮区也看到类似结构。8周后，毛囊种植区新生皮肤见到大量钉突样结构，表皮与其下真皮样组织结合紧密，表达大量vimentin，未发现皮脂腺及汗腺结构，刃厚植皮区也未发现腺体结构。 结论①自体毛囊移植后表皮细胞以毛囊为中心向外长出，修复创面。愈合创面有一定耐磨擦能力。 ②对于慢性大面积难治性创面的治疗，自体毛囊移植可以做为选择的方法之一。