黄芩苷抑制内皮损伤诱导的血管新生内膜形成及其机制

目的:血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)增殖是血管再狭窄的主要病理基础。黄芩苷(baicalin)是从中草药黄芩中分离出来的一种黄酮类化合物。以往研究发现,黄芩苷对肿瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用。但其是否影响血管内皮损伤所诱导的血管内膜增生尚不清楚。本研究从以下几方面探讨黄芩苷对血管新生内膜形成的影响及其作用机制。 方法: 1 VSMC的培养:按贴块法分离培养VSMC,取3～6代细胞进行实验。传代培养的VSMC生长到80%～90%汇合时,给予不同浓度黄芩苷(5、10、20、40μmol/L)预处理。 2 Western blot分析:取等量蛋白的提取液上样,进行SDS-PAGE。电转移至PVDF膜上。随后与相应的一抗及二抗反应,用化学发光法检测抗原抗体结合区带。用数码成像分析系统软件对结果进行定量分析。 3球囊损伤模型的复制及分组 将SD大鼠(250～300g)常规麻醉消毒,沿颈部正中线切口,暴露左侧颈外动脉,在颈外动脉剪一楔形切口,将球囊导管自切口插入至胸腹主动脉远心端,充盈球囊后反复回拉三次,退出,结扎颈外动脉,关闭切口。实验动物分假手术组、球囊损伤组、黄芩苷组。 4标本的处理 于术后14天从股动脉放血处死大鼠,分离颈总动脉,制备病理切片。 结果: 1黄芩苷抑制PDGF诱导的VSMC增殖 MTT分析结果表明,黄芩苷能以浓度(5、10、20、40μmol/L)依赖的方式抑制VSMC增殖,具有明显的量-效关系。 2黄芩苷对VSMC增殖标志基因PCNA表达的影响 免疫细胞化学和Western blot分析显示,正常细胞中PCNA呈低水平表达,PDGF (10 ng/ml)刺激后PCNA水平大幅度升高,而药物预孵育则使PCNA水平下降。提示黄芩苷具有抑制PDGF诱导的VSMC增殖的作用。 3黄芩苷抑制PDGF激活的PDGFR/MEK/ERK1/2信号通路 Western blot结果显示,PDGF刺激细胞15 min,PDGFR磷酸化水平明显升高;而经黄芩苷预处理的VSMC,磷酸化的PDGFR呈浓度依赖性的降低;进而对其下游的MEK、ERK1/2活性进行分析,发现MEK和ERK1/2磷酸化程度也随着药物浓度的增加逐渐降低;但磷酸化的JNK、p38、Akt不受药物处理的影响。提示黄芩苷是通过特异性抑制MEK/ERK1/2通路活化来抑制PDGF诱导的VSMC的增殖。 4黄芩苷抑制球囊损伤后血管内膜的增生 球囊损伤术后14天,黄芩苷组血管内膜的增生程度较球囊损伤组明显减轻,两组的血管内膜/中膜(I/M)厚度比分别为0.43±0.04和2.36±0.15,具有显著性差异(P < 0.01)。表明黄芩苷可以明显抑制球囊损伤诱导的血管内膜增生。 5黄芩苷抑制新生内膜中PCNA表达 形态学分析显示:正常血管内膜中仅有少量PCNA表达,球囊损伤14天后,血管中PCNA阳性的细胞数明显增多;而黄芩苷可明显抑制PCNA的表达,与模型组相比PCNA阳性的细胞数减少了53.4 %,具有显著性差异(P < 0.01)。提示黄芩苷可抑制血管细胞的增殖活性。 6黄芩苷抑制球囊损伤诱导的ICAM-1和VCAM-1的表达 免疫组织化学染色显示:正常血管内膜中可见极少量的ICAM-1和VCAM-1着色颗粒。球囊损伤14天后,两种蛋白阳性染色的细胞数及单细胞染色强度均较正常组显著增加。而黄芩苷能够显著抑制球囊损伤诱导的ICAM-1和VCAM-1的表达,与模型组相比阳性染色的细胞数分别降低了55.8±6.9%和57.2±5.5%,具有显著性差异(P<0.01,P<0.01)。 结论: 1黄芩苷抑制PDGF诱导的VSMC增殖。 2黄芩苷抑制VSMC增殖的机制与阻断PDGFR/MEK/ERK1/2信号通路有关。 3黄芩苷可预防内皮损伤所致的血管内膜增生和管腔狭窄。 4黄芩苷抑制血管内膜增生与其抑制血管细胞增殖和粘附分子表达有关。