益肺清化颗粒对Lewis肺癌小鼠血管生成因子VEGF、Endostatin影响的研究

目的： 本研究拟通过给C57BL/6小鼠右腋下接种肺癌瘤株建立小鼠肺癌模型,给予益肺清化颗粒药物干预,通过Elisa方法测定Lewis肺癌小鼠血清中VEGF、ES两种血管生成影响因子的表达水平；通过免疫组化方法测定Lewis肺癌小鼠瘤组织中VEGFES的蛋白表达水平；通过RT-PCR方法测定Lewis肺癌小鼠瘤组织中VEGF、ES的mRNA表达水平,以其探讨：①各组药物对Lewis肺癌小鼠瘤重、抑瘤率的影响②对照组、用药组血清中VEGFES的表达水平；③不同剂量益肺清化颗粒对VEGFES的表达水平的影响及其剂量之间的关系;④益肺清化颗粒联合吉非替尼用药后的效应关系。通过对上述问题的探讨,初步从血管生成方面探讨益肺清化颗粒治疗非小细胞肺癌的作用机制、为“益气养阴、清热解毒、活血化瘀”法治疗非小细胞肺癌提供实验依据、通过对作用机理的研究,更好地指导临床。 方法： C57BL/6J小鼠,清洁级,雄性,70只,体重18-20g,通过右腋下接种肺癌瘤株建立肺癌模型,小鼠按随机数字表随机分为7组：模型组,益肺清化颗粒低,中,高剂量组,吉非替尼(Gefitinib)组,吉非替尼(Gefitinib)+益肺清化颗粒中剂量组,环磷酰胺(CTX)组。于接种后第二天给予药物干预：对照组：0.4ml/只,无菌水灌胃,日一次、益肺清化颗粒低剂量组：5g/Kg,0.4ml/只,灌胃,日一次、益肺清化颗粒中剂量组：10g/Kg,0.4ml/只,灌胃,日一次、益肺清化颗粒高剂量组：10g/Kg,0.4ml/只,日两次、吉非替尼组100mg/Kg,0.2ml/只,灌胃,日一次、吉非替尼+益肺清化颗粒中剂量组：上午给Gefitinib0.2ml灌胃,下午给益肺清化颗粒中剂量0.4ml,灌胃、CTX组60mg/Kg,CTX组于接种第三天、第七天腹腔注射0.2ml,一共给药2次。连续给药14天。于给药14天后取材,留取小鼠眼球血后处死小鼠,剥离瘤块,2000rpm离心15min分离小鼠眼球血并留取血清置-70℃冰箱低温冷冻备用,用Elisa方法检测小鼠血清中VEGF、ES的表达水平；剥离瘤块后留取2块肿瘤组织放入标好号的进口无RNA酶的EP管中,立刻放入液氮中,用RT-PCR方法检测瘤组织中VEGF、ES mRNA表达水平。剩下瘤块放入盛有福尔马林溶液的广口瓶中,用免疫组化方法检测小鼠瘤组织中VEGF、ES的表达水平。 结果： 1各组药物对Lewis肺癌小鼠瘤重的影响 益肺清化颗粒低剂量组的瘤重与模型组无明显差异(P>0.05)；益肺清化颗粒中剂量组的瘤重与模型组相比较小,且有统计学意义(P<0.05);益肺清化颗粒高剂量组的瘤重与模型组相比有明显降低,且有明显的统计学意义(P<0.01)；Gefitinib组、Gefitinib+益肺清化颗粒中剂量组、CTX组瘤重均较模型组显著降低,且有显著的统计学意义(P<0.001) 2各组药物对Lewis肺癌小鼠抑瘤率的影响(抑瘤率=[1-(实验组瘤块重量／对照组瘤块重量)]×100%)。) 益肺清化颗粒低剂量组与模型组相比抑瘤率无明显差异(P>0.05);益肺清化颗粒中剂量组的抑瘤率较模型组增高,且有统计学意义(P<0.05)；益肺清化颗粒高剂量组的抑瘤率与模型组有差异,且有明显的统计学意义(P<0.01)；Gefitinib组以及Gefitinib+益肺清化颗粒中剂量组、CTX组较模型组均有较高的抑瘤率,且均具有显著的统计学意义(P<0.001) 3各组药物对Lewis肺癌小鼠血清VEGF、ES的ELISA研究 3.1VEGF 与模型组比较,益肺清化颗粒低剂量组Lewis肺癌小鼠血清VEGF表达降低,且有统计学意义(P<0.05)；益肺清化颗粒中剂量组VEGF较模型组减少,且有明显统计学意义(P<0.01)；益肺清化颗粒高剂量组、吉非替尼组、吉非替尼+益肺清化颗粒中剂量组、CTX组VEGF表达明显降低,且有显著统计学意义(P<0.001)。3.2ES 与模型组比较,益肺清化颗粒低剂量组Lewis肺癌小鼠血清ES值较模型组有所增加,但无统计学意义(P>0.05)；益肺清化颗粒中、高剂量组ES值增加,且有统计学意义(P<0.05)；吉非替尼组ES较模型组明显增加,且有显著的统计学意义(P<0.001)；吉非替尼+益肺清化颗粒组ES较模型组增加,且有明显的统计学意义(P<0.01)：CTX组Lewis肺癌小鼠血清ES较模型组明显增加,且有非常显著的统计学意义(P<0.001) 4各组药物对Lewis肺癌小鼠移植瘤瘤组织中VEGF、ES的免疫组化研究 4.1VEGF 各组药物对Lewis肺癌小鼠瘤组织中VEGF的表达均有显著的抑制作用,益肺清化颗粒低、中、高剂量组、吉非替尼组、吉非替尼+益肺清化颗粒中剂量组、CTX组与模型组相比均具有显著的统计学意义(P<0.001)4.2ES 各组药物对Lewis肺癌小鼠瘤组织中Endostatin的表达的影响作用为：益肺清化颗粒低剂量组ES的表达水平较模型组明显上调,且有明显统计学意义(P<0.01)；益肺清化颗粒中、高剂量组,吉非替尼组、吉非替尼+益肺清化颗粒中剂量组、CTX组ES的表达水平均较模型组显著升高,且有显著统计学意义(P<0.001) 5各组药物对Lewis(?)市癌小鼠移植瘤模型VEGF、ES的实时荧光定量PCR研究 5.1VEGF实时荧光定量PCR的统计结果 各组药物对Lewis肺癌小鼠瘤组织中VEGF的mRNA的影响结果为：益肺清化颗粒低剂量组与模型组相比有所降低,但无统计学差异(P>0.05)；益肺清化颗粒中剂量组与模型组有比较有统计学意义(P<0.05)；益肺清化颗粒高剂量组、吉非替尼组、吉非替尼+益肺清化颗粒中剂量组、CTX组均较模型组明显降低,且有显著的统计学差异(P<0.001) 5.2ES实时荧光定量PCR的统计结果 各组药物对Lewis肺癌小鼠瘤组织中Endostatin的mRNA的影响结果为：益肺清化颗粒低剂量组与模型组相比有所增加,但无统计学意义(P>0.05);益肺清化颗粒中剂量组、吉非替尼组与模型组相比有明显增加,且有明显统计学意义(P<0.01)益肺清化颗粒高剂量组、吉非替尼+益肺清化颗粒中剂量组、CTX组与模型组相比有显著的增加,且有显著的统计学意义(P<0.001) 结论： 1.益肺清化颗粒能减轻Lewis肺癌小鼠种植瘤的瘤重。 2.益肺清化颗粒有明显的抑瘤率。 3.益肺清化颗粒能抑制血管生成促进因子VEGF的表达,且对其作用效果存在剂量依赖关系。 4.益肺清化颗粒能促进血管生成抑制因子ES的表达,且对其作用效果存在剂量依赖关系。 5.吉非替尼+益肺清化颗粒中剂量联合的作用效果优于单一益肺清化颗粒中剂量用药,但与单一吉非替尼比较无明显增效作用。 6.益肺清化颗粒治疗非小细胞肺癌的作用机制与抑制肿瘤血管生成有关。