目的建立60Coγ辐射对体外培养的小鼠胸腺细胞损伤的病理模型,探讨在60Co辐射下,紫薯素抑制60Co诱导的小鼠胸腺细胞辐射损伤的作用机制。
方法建立紫薯素干预60Coγ辐射小鼠胸腺细胞的模型。应用MTT,首先检测60Coγ辐射在0～12h范围内对小鼠胸腺细胞活力的影响,60Co分为0,2,4,6Gy四个不同剂量进行单次辐射。不同剂量的紫薯素预处理细胞,MTT检测紫薯素对辐射细胞活力的影响、抗辐射的有效剂量以及其有无毒性反应。紫薯素对辐射细胞的作用检测中,通过DNA ladder检测细胞晚期凋亡;以流式细胞仪Annexin V-FITC/PI染色检测细胞早期凋亡;流式细胞仪PI染色检测细胞周期。
探讨紫薯素辐射防护作用的机制。测定紫薯素对氧化应激的影响:2,7-二氯氢化荧光素二酯（DCFH-DA）为荧光探针,检测紫薯素对60Co照射后细胞内活性氧（ROS）的影响;酶生化法测定抗氧化酶过氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧物酶（GSH-px）的活力。研究紫薯素对60Co诱导小鼠胸腺细胞凋亡的线粒体通路的影响:JC-1荧光染色测定线粒体膜电位;western-blot检测细胞色素C、caspase3和PARP的蛋白表达以及Bcl-2和Bax的蛋白表达;对caspase 3和caspase 9进行酶活性检测。研究紫薯素对60Co诱导小鼠胸腺细胞凋亡的死亡受体通路的影响:RT-PCR检测Fas mRNA;western-blot测定FADD的蛋白表达;caspase8酶活性的检测。检测紫薯素对60Co诱导小鼠胸腺细胞的MAPK途径的影响:western-blot测定磷酸化的ERK、JNK、p38MAPK的蛋白表达。探讨紫薯素对60Co诱导小鼠胸腺细胞p53的影响:RT-PCR检测p53 mRNA;Western-blot检测p53、p21Cip1和p27Kip1的蛋白表达。
结果MTT结果显示: 60Coγ辐射作用于细胞,降低了细胞活力;辐射各组细胞活力从4h开始急剧衰减。4Gy辐射后4h的细胞活力接近50%。本研究选择了4Gy辐射后4h建立细胞损伤模型。辐射后,在0.625g/L～2.500g/L浓度范围内,紫薯素能够提升辐射小鼠胸腺细胞的活力,其提升细胞活力的能力与剂量呈量效依赖关系,而且在此剂量范围内,紫薯素对细胞无毒性。DNA ladder显示:辐射后小鼠胸腺细胞产生明显的ladder,紫薯素干预使DNA ladder减弱。流式检测显示:紫薯素降低了辐射导致的小鼠胸腺细胞早期凋亡,同时缓解了辐射导致的G2/M期细胞周期阻滞。
紫薯素的防辐射机制试验结果显示:紫薯素降低了细胞内ROS的含量,提高了抗氧化酶SOD与GSH-px的活性;稳定了线粒体膜电位,减少细胞色素C的释放,降低caspase 3和PARP的蛋白表达,抑制caspase 9和caspase 3的酶活性,并使Bcl-2蛋白表达升高而Bax蛋白表达降低;对Fas mRNA和FADD蛋白表达无显著作用,但中、高剂量的紫薯素对caspase 8的酶活性有一定的提升;MAPK通路中,紫薯素对ERK活性的影响不明显,对磷酸化的JNK和p38MAPK表达有显著的抑制作用;紫薯素提高p53 mRNA与p53的蛋白表达,抑制p27Kip1的蛋白表达,对p21Cip1蛋白表达的作用不明显。
结论:紫薯素能够有效地抑制60Co辐射引起的小鼠胸腺细胞损伤,提高细胞活力,抑制细胞凋亡,缓解细胞周期阻滞。紫薯素的辐射防护机制包括:抑制了由60Co辐射诱导的细胞氧化损伤,降低ROS,提高抗氧化酶的活性,通过改善氧化还原状态抑制辐射诱导的凋亡;抑制线粒体凋亡信号通路,同时调节Bcl-2、Bax蛋白达到抑制凋亡的目的;对死亡受体凋亡信号通路无作用;MAPK途径中,抑制了JNK与p38MAPK磷酸化,对ERK活性没有影响;通过抑制p53的转录激活和蛋白表达,抑制辐射导致的细胞凋亡;通过抑制p53以及其下游的p27Kip1,缓解细胞周期阻滞。紫薯素通过调节多种基因与蛋白的表达,达到其抗氧化、抗凋亡、缓解细胞周期阻滞的辐射防护作用,有望成为应用广泛的60Co辐射防护剂。
