目的:柚皮苷(naringin,NG)是中药骨碎补中的重要组成成分。体内实验证实柚皮苷可以促进骨质疏松骨折愈合。体内实验证明柚皮苷可以促进成骨细胞(osteoblast,OB)的活性并抑制破骨细胞(osteoclast,OC)的骨吸收。但是OB与OC在体内存在相互偶联作用。柚皮苷对OB以及OC的单独作用不能反映体内的真实情况。Transwell小室对OB与OC的共培养可以较好的模拟体内微环境。近些年血管-骨偶联机制的提出表明骨再生与血管再生有着密切的关系。课题组前期研究表明柚皮苷可以促进骨质疏松骨折愈合早期血管新生。而血管新生主要由内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)归巢至损伤部位形成新生血管。因此,我们推测柚皮苷可能通过促进EPCs向内皮细胞(endothelial cells,ECs)分化,进而促进骨折愈合早期血管化。本研究目的在于:(1)运用Transwell小室建立成骨细胞破骨细胞共培养模型,不同柚皮苷后观察对成骨细胞骨形成以及破骨细胞骨吸收的影响,并应用PCR以及Western-blot等技术探讨柚皮苷对OB以及OC的可能作用机制。(2)通过体外分离大鼠骨髓EPCs,应用免疫荧光以及形态学等方法进行鉴定,应用MTT法确定柚皮苷作用的最佳浓度。应用Matrigel基质胶探讨观察柚皮苷对EPCs分化的影响,同时探讨基质衍生因子-1α(stroma-derived factor-1α,SDF-1α)趋化因子受体-4(chemokine receptor-4,CXCR-4)/磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase,PI3K)/Akt轴在柚皮苷对EPCs分化中的作用。方法:(1)、采用小鼠颅顶前成骨细胞MC3T3-E1细胞株和RAW264.7细胞株,参考既往文献确定OB和OC的细胞数量比例为2:1的比例,然后分别将MC3T3-E1和RAW264.7种于Transwell小室的上室和下室。下室用100μg/L的s RANKL进行诱导。分为对照组以及2ng/ml、20ng/ml、200ng/ml柚皮苷处理组,共培养7天后对下室OC进行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色染色和骨吸收陷窝鉴定,RT-PCR以及q RT-PCR分析成骨细胞保护素(osteoprotegerin,OPG)、核因子-κB受体活化因子配基(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)以及OPG/RANKL的比值和破骨细胞分化基因活化T细胞核因子-1(nuclear factor of activated T cells-1,NFATc-1)、活化T细胞核因子-2(nuclear factor of activated T cells-2,NFATc-2)和核因子κB受体活化因子(receptor activator of NF-κB,RANK)基因的相对表达量。检测成骨细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性。同时应用Western-blot技术探讨OPG、RANKL以及RANK的相对表达量。(2)选取4周龄Sprague Dawley(SD)大鼠,无菌分离股骨以及胫骨,运用骨髓EPCs分离液分离细胞并鉴定EPCs,四甲基偶氮唑盐比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法确定柚皮苷的最佳作用浓度后,PCR以及Western-blot法检测柚皮苷干预后SDF-1α以及CXCR-4的表达情况,同时检测CXCR4下游PI3K以及Akt信号通路激活情况。Matrigel基质胶探讨柚皮苷干预后血管形成的长度以及面积的变化。施加CXCR4受体的拮抗剂AMD3100以及PI3K的抑制剂LY294002,探讨施加这两种受体后血管长度以及面积的变化,同时应用PCR以及Western-blot检测SDF-1α、CXCR-4、PI3K以及Akt的变化。数据分析采用SPSS 20.0分析图形绘制采用Graphpad 6.01。结果:1、与对照组比较,柚皮苷可以同时促进成骨细胞OPG、RANKLm RNA以及蛋白的表达量并且可以提高OPG/RANKL的比值,以20ng/ml柚皮苷最为明显,差异有统计学意义(P<0.05);20ng/ml柚皮苷TRAP阳性细胞数明显少于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);柚皮苷组骨吸收陷窝面积低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),20 ng/ml以及200ng/ml柚皮苷低于2ng/ml柚皮苷组,差异有统计学意义(P<0.05)。柚皮苷可以抑制破骨细胞分化相关基因NFATc-1、NFATc-2的表达,促进RANK m RNA以及蛋白的表达,以20ng/m L柚皮苷效果最为明显,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。2、MTT结果显示柚皮苷对EPCs的最佳剂量为500ng/ml,与对照组比较,500ng/ml的柚皮苷可以促进EPCs在基质胶形成血管的面积和长度,差异有统计学意义(P<0.05)。PCR以及Western-blot结果显示,500ng/ml的柚皮苷可以促进EPCs的SDF-1α以及CXCR-4的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,AMD3100以及LY294002作用后,基质胶上血管形成的面积和长度减少,差异有统计学意义(P<0.05)。与AMD3100组比较,柚皮苷联合AMD3100可以增加基质胶上血管形成的面积和长度,差异均有统计学意义(P<0.05)。与LY294002组比较,添加柚皮苷后可以增加基质胶上血管形成的面积以及长度,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1、共培养体系下,柚皮苷可以促进成骨细胞活性并抑制破骨细胞骨吸收能力。可能通过调节OPG/RANKL的比值实现。2、柚皮苷可以在体外促进内皮祖细胞的增殖以及成血管能力,并且可能通过SDF-1α/CXCR4/PI3K/Akt信号通路。
