周期性机械应力促进大鼠软骨细胞增殖和细胞外基质合成的机制研究

目的探讨ERK1/2在周期性机械应力促进大鼠软骨细胞增殖和细胞外基质合成中的作用。 方法第一阶段，取第二代大鼠软骨细胞，随机分为加压组和对照组，加压组给予周期性机械应力（200KPa，0.1Hz）刺激，对照组不给于特殊处理。两组细胞分别培养，0、0.5、1和2小时后采用Western blot检测ERK1/2的表达和磷酸化水平；8小时后采用Real-time PCR检测aggrecan和type II collagen的基因表达水平；每天8小时，3天后采用直接计数法和CCK-8法检测细胞增殖。 第二阶段，取第二代大鼠软骨细胞，随机分为预处理组和对照组，预处理组分别采用ERK1/2特异性抑制剂（PD98059）和针对ERK1/2的shRNA阻断ERK1/2的活化，对照组不给予特殊预处理。两组细胞分别在有、无周期性机械应力条件下培养，8小时后采用Real-time PCR检测aggrecan和type II collagen基因表达水平；每天8小时，3天后采用直接计数法和CCK-8法检测细胞增殖。 结果周期性机械应力能促进软骨细胞增殖和细胞外基质合成明显增加，而且ERK1/2的磷酸化水平显著增高，差异均具有统计学意义（p <0.05foreach）。但是，当ERK1/2的活化水平被抑制以后，周期性机械应力促进的软骨细胞增殖和细胞外基质合成均明显降低，差异均具有统计学意义（p <0.05foreach）。 结论周期性机械应力能够促进大鼠软骨细胞增殖和细胞外基质合成，在此过程中ERK1/2发挥了重要的信号传导作用。 目的探讨PLCγ1和Rac1在周期性机械应力促进大鼠软骨细胞增殖和细胞外基质合成中的作用以及Rac1、PLCγ1和ERK1/2三者之间的相互关系。 方法第一阶段，取第二代大鼠软骨细胞，随机分为加压组和对照组，加压组给予周期性机械应力（200KPa，0.1Hz）刺激，对照组不给于特殊处理。两组细胞分别培养，0、0.5、1和2小时后采用Western blot检测PLCγ1和Rac1的表达和磷酸化水平；1小时后采用Rac1GTPase activity assay检测Rac1的活化水平。 第二阶段，取第二代大鼠软骨细胞，随机分为预处理组和对照组，预处理组分别采用PLCγ1特异性抑制剂（U73122）和Rac1的特异性抑制剂（NSC23766）阻断PLCγ1和Rac1的活化，对照组不给予特殊预处理。两组细胞分别在有、无周期性机械应力条件下培养，1小时后采用Western blot检测ERK1/2、PLCγ1和Rac1的表达和磷酸化水平；8小时后采用Real-time PCR检测aggrecan和typeII collagen的基因表达水平；每天8小时，3天后采用直接计数法和CCK-8法检测细胞增殖。 结果周期性机械应力能促进PLCγ1和Rac1的磷酸化水平以及Rac1的活化水平均明显增高，差异均具有统计学意义（p <0.05for each）。但是，当PLCγ1的活化水平被抑制以后，周期性机械应力促进的软骨细胞增殖和细胞外基质合成均显著降低，而且ERK1/2的磷酸化水平也明显下降，差异均具有统计学意义（p <0.05for each），而Rac1的磷酸化水平则没有显著改变，差异没有统计学意义（p>0.05）。当Rac1的活化水平被抑制以后，周期性机械应力上调的软骨细胞增殖和细胞外基质合成均明显降低，而且ERK1/2的磷酸化水平也显著下降，差异均具有统计学意义（p <0.05for each），而PLCγ1的磷酸化水平则没有明显影响，差异没有统计学意义（p>0.05）。 结论PLCγ1和Rac1相互平行，共同调控ERK1/2，从而介导周期性机械应力下大鼠软骨细胞增殖和细胞外基质合成。 目的探讨Src在周期性机械应力促进大鼠软骨细胞增殖和细胞外基质合成中的作用以及Src与Rac1、PLCγ1、ERK1/2之间的相互关系。 方法第一阶段，取第二代大鼠软骨细胞，随机分为加压组和对照组，加压组给予周期性机械应力（200KPa，0.1Hz）刺激，对照组不给于特殊处理。两组细胞分别培养0、0.5、1和2小时后采用Western blot检测Src的表达和磷酸化水平。 第二阶段，取第二代大鼠软骨细胞，随机分为预处理组和对照组，预处理组分别采用Src特异性抑制剂（PP2）和针对Src的shRNA阻断Src的活化，对照组不给予特殊预处理。两组细胞分别在有、无周期性机械应力条件下培养，1小时后采用Western blot检测ERK1/2、PLCγ1和Rac1的表达和磷酸化水平；8小时后采用Real-time PCR检测aggrecan和type II collagen的基因表达水平；每天8小时，3天后采用直接计数法和CCK-8法检测细胞增殖。 第三阶段，取第二代大鼠软骨细胞，随机分为预处理组和对照组，预处理组分别采用PLCγ1特异性抑制剂（U73122）和Rac1的特异性抑制剂（NSC23766）阻断PLCγ1和Rac1的活化，对照组不给予特殊预处理。两组细胞分别在有、无周期性机械应力条件下培养1小时后采用Western blot检测Src的表达和磷酸化水平。 结果周期性机械应力能促进Src的磷酸化水平均明显增高，差异均具有统计学意义（p <0.05for each）。但是，当Src的活化水平被抑制以后，周期性机械应力促进的软骨细胞增殖和细胞外基质合成均显著降低，而且ERK1/2、PLCγ1和Rac1的磷酸化水平也明显下降，差异均具有统计学意义（p <0.05foreach）。当PLCγ1和Rac1的活化水平被抑制以后，周期性机械应力上调的Src的磷酸化水平均没有明显改变，差异均没有统计学意义（p>0.05for each）。 结论周期性机械应力下，Src通过调控Rac1、PLCγ1和ERK1/2介导大鼠软骨细胞增殖和细胞外基质合成。 目的探讨integrinβ1和integrinβ3在周期性机械应力促进大鼠软骨细胞增殖和细胞外基质合成中的作用以及integrinβ1与相应信号蛋白之间的相互关系。 方法第一阶段，取第二代大鼠软骨细胞，随机分为加压组和对照组，加压组给予周期性机械应力（200KPa，0.1Hz）刺激，对照组不给于特殊处理。两组细胞分别培养8小时后采用Real-time PCR检测integrinβ1和integrinβ3的基因表达水平。 第二阶段，取第二代大鼠软骨细胞，随机分为预处理组和对照组，预处理组分别采用integrinβ1和integrinβ3的功能阻断型抗体抑制integrinβ1和integrinβ3的活化，对照组不给予特殊预处理。两组细胞分别在有、无周期性机械应力条件下培养，8小时后采用Real-time PCR检测aggrecan和type II collagen基因表达水平；每天8小时，3天后采用直接计数法和CCK-8检测细胞增殖。 第三阶段，取第二代大鼠软骨细胞，随机分为预处理组和对照组，预处理组采用integrinβ1的功能阻断型抗体抑制integrinβ1的活化，对照组不给予特殊预处理。两组细胞分别在有、无周期性机械应力条件下培养1小时后采用Westernblot检测Src、Rac1、PLCγ1和ERK1/2的表达和磷酸化水平。 结果周期性机械应力能促进integrinβ1的基因表达水平明显增高，差异具有统计学意义（p <0.05），而integrinβ3的基因表达水平没有显著变化，差异没有统计学意义（p>0.05）。当integrinβ1被抑制以后，周期性机械应力促进的软骨细胞增殖和细胞外基质合成均明显降低，而且Src、Rac1、PLCγ1和ERK1/2的磷酸化水平也显著下降，差异均具有统计学意义（p <0.05for each）。当integrinβ3被抑制以后，周期性机械应力上调的软骨细胞增殖和细胞外基质合成均没有明显改变，差异均没有统计学意义（p>0.05for each）。 结论在周期性机械应力作用下，integrinβ1通过调控Src、Rac1、PLCγ1和ERK1/2介导了大鼠软骨细胞增殖和细胞外基质合成。 综上所述，本课题揭示了周期性机械应力促进大鼠软骨细胞增殖和细胞外基质合成的信号传导机制，其机制是大鼠软骨细胞膜上的integrinβ1感知了周期性机械应力后激活下游的Src，后者又促进了Rac1和PLCγ1的活化，Rac1和PLCγ1通过调控ERK1/2的磷酸化水平最终介导细胞增殖和细胞外基质合成。简言之，周期性机械应力促进大鼠软骨细胞增殖和细胞外基质合成通过integrinβ1-Src-Rac1/PLCγ1-ERK1/2信号通路。