成纤维细胞生长因子受体4、Her2及雌激素受体在乙肝病毒相关性肝细胞癌中的研究

研究背景:原发性肝癌(简称肝癌)是指肝细胞和/或肝内胆管上皮细胞发生的恶性肿瘤,其中肝细胞癌(HCC)最常见的组织类型。肝癌的临床治疗以手术为主,但是由于肝癌起病隐匿,早期不易被察觉,部分患者在发现时已经错过手术的最佳时机。随着肿瘤分子机制和相关信号转导通路研究的进展,目前分子靶向药的应用已成为临床上治疗肿瘤的热点之一,许多特异性靶向药在相关肿瘤的治疗中都获得了良好的疗效。然而,由于肝细胞癌的发生机制涉及众多的因素,至今尚未发现针对肝细胞癌特异性靶点的靶向药物。迄今,临床上常用的肿瘤靶向药物大多数为酪氨酸激酶抑制剂,而成纤维细胞生长因子受体家族(FGFRs)即是一类酪氨酸激酶受体。目前已经确定的该家族成员有五种(FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4及FGFR5),其中,FGFR4是FGFRs家族中分布最广泛的成员。FGFR4主要表达在成熟的肝细胞内,但是,在HCC中的研究报道较少。Her2蛋白是由Her2原癌基因编码的跨膜蛋白,同样属于酪氨酸激酶受体家族成员。正常情况下,Her2蛋白参与细胞的生长、分化等一系列正常的生理活动。当受到致癌因素作用之后Her2基因可以异常活化,主要表现为基因扩增导致蛋白过度表达,刺激细胞持续增生。目前,在乳腺癌、胃癌等许多恶性肿瘤组织中已发现由Her2基因扩增导致的Her2蛋白过表达。Her2单克隆抗体(曲妥珠单抗等)在治疗晚期乳腺癌和胃癌的临床应用中得到了良好的效果,但有关Her2与肝细胞癌的关系,研究报道较少。雌激素受体(ER)主要包括ERα、ERβ两种类型,在人体内以ERα为主。ERα蛋白的分子量为66KDa,因此也被称为ERα66。由于ERα66基因的选择性剪接作用,产生了ERα46、ERα36等剪接变异体。ERα66蛋白主要在肿瘤细胞核中表达,而ERα36蛋白主要在肿瘤细胞质和/或细胞膜中表达。有研究报道,ERα36可能通过某种途径上调Her2蛋白的表达,促进肿瘤细胞增殖,但有关ERα与肝细胞癌发生、发展关系的研究报道较少。乙肝病毒(HBV)是诱发慢性肝病的重要因素之一,我国大约有80%的肝细胞癌是由于感染HBV所导致的,但是有关HBV与HCC中FGFR4蛋白,Her2蛋白及ERα蛋白表达之间的关系,国内外尚未见相关研究报道。本研究的目的是用免疫组化、荧光原位杂交以及PCR-荧光探针方法,研究乙肝病毒相关性肝细胞癌组织中FGFR4,Her2,ERα,HBsAg蛋白的表达、Her2基因的扩增以及HBV DNA含量的变化;分析各指标之间有无相关性以及与临床病理参数之间的关系,为进一步研究HCC的发生、发展机制提供新方向,为寻找肝细胞癌的分子治疗靶点提供研究基础。方法:1.材料来自大连医科大学附属二院2014年1月—2017年3月期间临床病理资料完整的术后肝组织存档蜡块103例,其中有HBV感染病史的肝细胞癌(HCC+HBV组)50例,无HBV感染病史的肝细胞癌(HCC组)13例,有HBV感染病史的肝硬化组20例,正常肝组织20例。2.采用免疫组化方法检测组织中FGFR4、Her2、ERα及HBsAg蛋白的表达;采用荧光原位杂交(FISH)方法检测癌组织中Her2基因的扩增状况;采用PCR-荧光探针法检测癌及癌旁组织中HBV DNA的含量。3.使用SPSS21.0软件对实验数据进行分析,计数资料的组间比较采用c2检验,Fisher确切概率法;计量资料的组间差异采用独立样本t检验,单因素方差分析;变量间的相关性采用Spearman相关系数,以P<0.05表示差异有统计学意义。结果:1.免疫组化结果(1)FGFR4蛋白表达:1)肝细胞癌组织(包括HCC+HBV组和HCC组)中FGFR4的表达量低于癌旁组织(P<0.05);2)在HCC+HBV组,癌组织中FGFR4的表达量与肿瘤最大径有关;肿瘤最大径<3cm的癌组织中FGFR4表达量高于肿瘤最大径≥3cm的癌组织中表达量(P<0.05)。3)在HCC+HBV组,癌旁组织中FGFR4的表达量与肿瘤的临床分期有关;T1+T2期的癌旁组织中FGFR4表达量低于T3+T4期癌旁组织FGFR4的表达量(P<0.05)。(2)Her2蛋白表达:癌组织(包括HCC+HBV组和HCC组)的Her2蛋白表达评分为(0)46例、(1+)8例、(2+)9例、(3+)0例;在癌旁组织中未见Her2蛋白表达。(3)ERα蛋白表达:1)ERα蛋白在细胞核中的表达(核阳性):癌组织中(包括HCC+HBV组和HCC组)ERα核阳性率显著低于在癌旁组织中ERα核阳性率(P<0.05);癌组织中ERα核阳性率与性别相关,女性肝细胞癌ERα核阳性率高于男性肝细胞癌ERα核阳性率(P<0.05)。2)ERα蛋白在细胞质/膜中的表达(质/膜阳性):在HCC+HBV组,癌组织中ERα质/膜阳性率明显高于癌旁组织、肝硬化组及正常组中ERα质/膜的阳性率;在HCC组,癌组织中ERα质/膜阳性率高于肝硬化组和正常组的ERα质/膜的阳性率,以上差异均有统计学意义(P<0.05)。(4)HBsAg蛋白的表达:在HCC+HBV组,癌旁组织中HBs Ag的阳性率(50%)明显高于癌组织HBsAg的阳性率(2%,P<0.05)。2.FISH检测Her2基因扩增结果针对Her2免疫组化评分为(2+)的样本,用FISH方法检测癌组织中Her2基因的扩增情况,结果显示,未检测到Her2基因扩增。3.PCR-荧光探针法检测组织中HBV DNA结果(1)癌和癌旁组织中均检测到HBV DNA,但两者的HBV DNA含量(Ct值)无统计学差异(P>0.05)。(2)HBsAg阳性组的癌组织和癌旁组织中的HBV DNA含量分别高于HBsAg阴性组的癌组织和癌旁组织中的HBV DNA含量(P<0.05)。结论:1.肝细胞癌组织中FGFR4蛋白表达量低于癌旁组织;肿瘤较小的癌组织FGFR4蛋白的表达量高于肿瘤较大的癌组织中FGFR4蛋白的表达量;肿瘤分期较低的癌旁组织中FGFR4蛋白的表达量低于肿瘤分期较高的癌旁组织FGFR4的表达量;提示FGFR4蛋白在肝细胞癌的发生、发展过程中可能起抑制作用。2.肝细胞癌组织中可检测到Her2蛋白表达,但未检测到Her2基因扩增,提示Her2蛋白在肝细胞癌发生、发展过程中所起的作用有待进一步研究。3.肝细胞癌组织中ERα蛋白核阳性率低于癌旁组织,质/膜阳性率高于癌旁组织;女性肝细胞癌ERα蛋白核阳性率高于男性肝细胞癌ERα核阳性率,提示ERα蛋白在细胞核中表达可能起着抑制肝细胞癌发生、发展的作用,而在细胞质/膜中表达的ERα蛋白则可能起着促进肝癌发生、发展的作用。4.在HBsAg阳性组中,癌和癌旁组织的HBV DNA均高于HBsAg阴性组中癌及癌旁组织的HBV DNA含量,提示HBsAg的表达量可以反应肝组织中HBV DNA的相对含量;HBsAg阳性是肝细胞癌不良预后因素之一。5.肝细胞癌组织中HBsAg表达量低于癌旁组织,而HBV DNA含量与癌旁组织无差异或高于癌旁组织中的HBV DNA含量;提示在肝细胞癌组织中HBV的复制水平低于癌旁组织,而HBV DNA的整合能力高于癌旁组织。