周期性张应力对大鼠生长板软骨细胞的作用及相关机制

目的： 1.研究大鼠生长板软骨细胞和骨髓间充质干细胞的体外三维培养和共培养,并探讨两者作为组织工程种子细胞的优缺点。 2.研究周期性张应力对大鼠生长板软骨细胞增殖的影响及ERK和YAP蛋白的作用。 3.观察FAK、细胞骨架F-actin和RhoA通路在周期性张应力对大鼠生长板软骨细胞力学传导中的作用。 方法： 1.分别取大鼠生长板软骨细胞和骨髓间充质干细胞,显微镜下观察细胞形态。骨髓间充质干细胞行三系分化诱导并检测分化能力。将细胞行3D培养和共培养,实验分三组：生长板软骨细胞单独培养组、骨髓间充质干细胞单独培养组和共培养组。Real-time PCR检测三组细胞成软骨分化基因的表达,免疫组织化学方法检测细胞外基质的表达情况。 2.采用四点弯曲张力仪,对体外培养的大鼠生长板软骨细胞行周期性张应力,Western Blot检测YAP和ERK蛋白的活化及细胞增殖相关蛋白PCNA和CyclinDl的表达,Real-time PCR检测C-Fos和CTGF基因的表达。阻断细胞ERK或YAP蛋白的活性,Western Blot和流式细胞术检测力学刺激对细胞增殖作用的改变。 3.对大鼠生长板软骨细胞行周期性张应力,Western Blot检测FAK和RhoA蛋白的表达。免疫荧光观察应力对细胞骨架F-actin的作用。阻断细胞FAK或RhoA活性,以及抑制细胞骨架F-actin聚集,Western Blot检测张应力对YAP和ERK蛋白表达的变化。 结果： 1.大鼠生长板软骨细胞呈三角形或短梭形,而大鼠骨髓间充质干细胞呈长梭形。骨髓间充质干细胞具有三系分化的能力。尽管早期共培养组成软骨分化能力要强于其他两组,但后期大鼠生长板软骨细胞单独培养组的成软骨分化能力最强。 2.大鼠生长板软骨细胞在受到3000μ strain、0.5Hz的张应力刺激1h时,YAP和ERK蛋白的活性最高,C-Fos和CTGF基因mRNA表达水平也最高。适宜的力学刺激能促进细胞增殖,改变细胞周期,并且抑制YAP和ERK的活性可阻断该作用。 3.周期性张应力能促进大鼠生长板软骨细胞FAK和RhoA蛋白的活化,以及细胞骨架F-actin聚集。给予细胞PF573228、C3toxin以及细胞骨架松弛素D,可阻断应力活化YAP和ERK蛋白。 结论： 1.大鼠生长板软骨细胞和骨髓间充质干细胞作为组织工程的种子细胞各自有优缺点,3D培养和共培养有益于生长板组织工程的发展。 2.周期性张应力可促进大鼠生长板软骨细胞增殖,YAP和ERK蛋白发挥了一定的作用。 3.周期性张应力通过FAK、RhoA和细胞骨架F-actin影响大鼠生长板软骨细胞ERK和YAP蛋白的表达。