氨基硫脲类螯合剂由抑制SOD1调控活性氧ERK信号通路

活性氧(Reactive oxygen species, ROS)是动植物体内有氧代谢过程中产生的一系列氧化能力强、化学性质活泼的含氧物总称。ROS不仅能直接通过氧化损伤影响DNA或蛋白质的结构和功能,同时也是胞内重要的氧化还原信号分子。ROS作为信号分子将细胞外的刺激信号由细胞膜传至细胞内,并作用于胞内靶标蛋白激发信号级联反应。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases, MAPKs)是信号从细胞表面传导到细胞核内的重要激酶,MAPKs级联激活是多种信号通路的中枢,MAPKs信号转导的激活使包括细胞增殖必需基因在内的许多基因的表达上调,在细胞增殖相关信号通路中具有关键作用。刺激信号从胞外传递到胞内须通过MAPKs信号转导通路的三级激酶级联反应，细胞外调节蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases, ERK)是将信号从表面受体传导至细胞核的关键。ERK通路的活化被认为与细胞的分化、癌变和恶性进展程度等密切相关,而ERKl/2的磷酸化被认为是该信号通路活化的标志之一。ROS信号转导的激活和激酶的级联反应主要取决于胞内H202的浓度,因此研究胞内ROS信号转导通路的关键在于直接调控胞内H202的浓度。局部高浓度的H2O2能氧化活性部位保守的半胱氨酸残基使PTP等信号蛋白失活,从而激活MAPKs信号转导。铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)作为生物机体内最重要的抗氧化酶之一在催化O2·-岐化为H202,调控细胞内H202和02-的稳态浓度方面具有重要作用。SOD1是调控细胞内氧化还原信号转导的关键蛋白之一,抑制SOD1,使H202达不到氧化PTP所需要的水平,PTP保持活化,使胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)去磷酸化,氧还信号网络将受到显著影响。通过设计特异的螯合型抑制剂,合理调控SOD1的酶活性,研究和分析细胞内H2O2和02·-浓度变化对ERK1/2信号通路的影响,这对我们理解MAPKs信号转导通路中各种激酶的激活机制乃至多种病理生理过程具有十分重要的意义。本论文主要进行了以下几个方面的工作：1,合成了系列对SOD1具有显著抑制作用的螯合型抑制剂并对其进行结构优化,优化后的螯合剂在金属结合能力、细胞跨膜、抑制能力等方面具有明显优势。2,我们通过RT-PCR及Western Blot方法对细胞内的SOD1蛋白表达进行了研究,确定了螯合剂对SOD1酶活性的抑制途径。3,综合运用电位滴定、电子顺磁、圆二色谱、X-射线小角散射SAXS及AutoDock计算软件等方法对抑制剂的结构、性质、“构-效”关系、作用机制等方面展开了研究。同时根据SOD1的结构特点和催化机理,对抑制剂的螯合基团与活性基团的协同作用及抑制机理进行了讨论。4,我们根据实验结果,分析了胞内H202和O2-浓度变化与螯合剂的剂量和半抑制浓度1C50值之间的关系。结合螯合剂对胞内ERK1/2及其磷酸化水平的影响,确定了SOD1活性的调控与MARKs信号转导通路之间的关联性,为ERK信号通路的研究奠定了一定的基础。5,通过细胞色素c氧化酶及酪氨酸酶活性实验,分析了螯合剂对胞内铜传输途径的影响,考察了螯合剂对其他含铜蛋白的选择性,这对探讨和深入研究螯合剂的靶向性至关重要。6,比较螯合剂对不同细胞系的生长影响和促调亡作用,探讨螫合剂通过改变胞内H202和O2·-浓度的相对水平,由调控胞内氧还信号转导导致细胞凋亡或死亡的作用机制。