花生抗黄曲霉相关基因的分离与表达

花生是我国重要的经济作物与油料作物,是最容易受黄曲霉感染的农作物之一,黄曲霉污染不仅直接危害人们的健康而且影响花生的品质和外贸出口,所以人们一直设法采取各种措施有效防止黄曲霉污染。 应用抗病品种是病害防治最直接有效的方法,但花生抗黄曲霉种质资源匮乏加之常规育种周期长使得抗病品种远不能满足生产需求。随着生物技术的发展运用基因工程手段将外源抗病基因导入花生中为其抗病育种带来了新的希望。 本研究以基因芯片技术结合荧光定量PCR技术,从花生抗、感两品种中分离差异表达基因,并利用RACE技术获得基因全长,构建原核表达载体,为培育花生抗黄曲霉新品种奠定了基础。研究的主要结果如下: 1.使用已有的61078组大豆杂交探针对花生抗、感两品种进行杂交。结果表明与金花1012相比,J11种皮中共有上调表达152条且SLR＞1的基因,下调表达236条且SLR＞1的基因,对这些差异表达基因进行BLAST分析,共筛选出功能已知或者与已知相近的基因75条。 2.利用改良Trizol一步法,分别提取黄曲霉侵染10d、20d、30d后抗病品种J11种皮的RNA(收获前40d开始侵染并设对照组),依据基因芯片结果选出13条基因进行实时荧光定量PCR,结果表明侵染前后有显著差异表达的基因6条,对这6条基因进行研究。 3.利用RACE技术,从提取的高质量RNA中获得了AW86基因全长序列,基因全长为828bp,含有一个666bp的开放读码框,分析发现该基因ORF所编码的氨基酸有一个植物过氧化氢酶的保守序列,与大豆、鹰嘴豆等豆科植物有高度同源性。含过氧化氢酶结构域的转录因子与多种生理生化反应的信号转导有关,参与抗病、抗虫反应基因的表达,从而可利用这些蛋白提高花生对黄曲霉侵染的抵抗力。 4.根据获得的全长序列设计带有酶切位点的引物,利用PCR技术扩增AW86基因的ORF片段,将其与表达载体PGEX-T4-1连接后,导入大肠杆菌BL21中诱导表达,然后将蛋白产物进行SDS-PAGE电泳,得到分子量为70KD的特异表达产物,说明目的基因全长包含一个完整的cds,可进一步研究。