薄荷酚类部位化学成分及抗炎活性研究

薄荷作为我国传统中药,具有疏散风热、清利头目、利咽、透疹、疏肝行气等功效,在我国已有两千多年的药食两用历史。药理研究表明薄荷含有的多种酚类成分,是薄荷发挥抗炎、抗菌抗病毒作用的重要活性成分。然而,关于薄荷酚类部位及其化学成分在抗炎方面的深入研究却未曾报道。为了充分挖掘薄荷酚类部位及其化学成分的药用价值,本论文开展相关研究。采用HPLC-MS/MS法研究薄荷酚类部位的化学成分,共鉴定推断出15个化学成分：原儿茶醛、对香豆酸、咖啡酸、迷迭香酸乙酯、对香豆酰奎宁酸、紫草酸乙酯、紫草酸、芹菜素-7-O-芸香糖苷、橙皮苷、香叶木苷、迷迭香酸、丹酚酸D、丹酚酸B、蒙花苷和麝香草素。质谱分析数据结果为薄荷酚类部位抗炎活性成分的筛选奠定基础。建立了北京市售薄荷药材酚类部位的HPLC特征图谱,选取了11个色谱峰为共有峰,并以迷迭香酸为参照峰,计算各个共有峰的相对保留时间均小于3%。方法学考察了精密度、稳定性和重现性均符合要求,12个薄荷酚类部位特征图谱的相似度在0.9以上,说明12批北京市售薄荷药材的酚类部位整体质量相似度较高。采用聚类分析和主成分分析对12批薄荷药材的酚类部位HPLC特征图谱进行评价,将12批薄荷药材的酚类部位分为三类,不同类别间质量有差异。采用三氯化铁-铁氰化钾比色法,以迷迭香酸为对照品对薄荷酚类部位总酚酸含量进行测定。采用HPLC法对薄荷酚类部位中主要化学成分迷迭香酸和蒙花苷进行含量测定,结果表明迷迭香酸和蒙花苷在薄荷酚类部位中的含量较高。采用MTT法研究酚类部位、蒙花苷和迷迭香酸对RAW264.7细胞活性的影响。结果显示酚类部位、迷迭香酸和蒙花昔的无毒浓度范围分别为0～200μg/mL.0～160μM和 0～20 μM。利用LPS诱导的RAW264.7细胞建立体外炎症模型,研究不同给药浓度的酚类部位及其有效成分对炎性介质NO、炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的影响。结果显示,LPS (1μg/mL)能够显著升高RAW264.7细胞中NO、TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平；不同给药浓度的酚类部位(50、100和200 μg/mL)、迷迭香酸(10、40和160μM)和蒙花苷(5、10和20 μM)处理细胞24 h后,NO、TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量呈现不同程度得降低。通过分析酚类部位、蒙花苷和迷迭香酸对NO、TNF-α、IL-1β和IL-6的抑制率,结果表明酚类部位对NO、TNF-α、IL-1β和IL-6抑制率最大,蒙花苷对NO、TNF-α和IL-6的抑制率高于迷迭香酸；蒙花苷和迷迭香酸均对IL-1p有着较高的抑制率。研究结果表明,酚类部位、迷迭香酸和蒙花苷能够通过调节炎性细胞因子和炎性介质的分泌水平而发挥抗炎作用,三者的抗炎强弱依次是酚类部位、蒙花苷、迷迭香酸。采用qRT-PCR法测定不同给药浓度的酚类部位(50、100和200μg/mL)和蒙花苷(5、10和20 gM)对iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的影响,结果显示,LPS(1μg/mL)能够显著升高RAW264.7细胞iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表达水平,酚类部位和蒙花苷预处理细胞后能够不同程度得下调iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表达水平。研究结果表明,酚类部位和蒙花苷能够通过下调iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表达水平抑制NO、TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子的分泌,从而发挥抗炎作用。采用Western-blot法研究不同给药浓度酚类部位(50、100和200μg/mL)和蒙花苷(5、10和20μM)对NF-kB、MAPK和PI3K/Akt信号通路的影响。研究结果表明酚类部位能够通过抑制LPS诱导的iKBα、p65、 ERK、JNK和p38蛋白的磷酸化抑制NF-κB和MAPK信号通路的活化；蒙花苷能够通过抑制LPS诱导的IKBα、p65、ERK、JNK和p38蛋白的磷酸化以及p65蛋白核转位,抑制NF-κB和MAPK信号通路。酚类部位和蒙花苷均对Akt蛋白的磷酸化无抑制作用。试验结果说明酚类部位和蒙花苷能够通过抑制NF-κB和MAPK信号通路,下调iNOS、NF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表达水平,从而抑制NO、TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌,进而发挥抗炎作用。