大豆黄酮对大鼠视神经急性损伤的保护效应及机制研究

研究目的： 视神经损伤（injury of the optic nerve）根据解剖学可分为眼内段损伤、眶内段损伤、管内段损伤和颅内段损伤。目前常将视神经管区视神经损伤称之为外伤性视神经病变（traumatic optic neuropathy，TON），是头面部和眼眶外伤的严重并发症或伴随损伤，也是导致患者失明的重要原因之一。目前临床上多以应用糖皮质激素、改善微循环营养药物、视神经管减压术等治疗方法来控制外伤性视神经损害，但是伤后视力和视野的恢复均不理想，对促进视神经功能修复的有效手段也还一直存在着争论。因此，寻找对视神经损伤后修复、再生起有效作用的治疗药物成为治疗外伤性视神经病变的研究焦点。 最新的研究表明大豆黄酮（Daidzein）对外周神经系统神经元轴突的再生及抗凋亡均有明显作用，但其具体作用机制都还没有得以充分的证实和阐述。本研究拟通过大豆黄酮在大鼠视神经急性损伤的玻璃体腔内干预，观察其对视神经急性损伤的保护和修复作用并阐述其可能的机制。 研究方法： 本课题研究分为三部分，第一部分和第二部分通过HE染色、免疫组织化学和Western Blot的方法观察不同实验组（A：正常组，B：阴性对照组，C：10μmol/l大豆黄酮治疗组，D：100μmol/l大豆黄酮治疗组，E：1000μmol/l大豆黄酮治疗组，F：100ng/ml mNGF阳性对照组）和不同时间点（分别为100μmol/l大豆黄酮干预后的1d、3d、7d、14d和28d）大鼠视网膜的病理组织形态、凋亡性蛋白Caspase-3的表达以及神经生长相关蛋白GAP-43的表达。第三部分原代培养大鼠的视网膜神经细胞，通过免疫组织化学鉴定培养的细胞；通过流式细胞仪定量检测各组神经细胞的存活和凋亡情况，并通过RT-PCR检测基因GAP-43、Bcl-2和Bax的mRNA表达情况。 结果： 第一部分 1．HE染色结果：不同浓度的大豆黄酮治疗组干预后3d后，与阴性对照组相比，大鼠视网膜组织结构区分明显，内核层、外丛状层、外核层结构依然紧密，与阳性对照组的视网膜结构比较无明显的差异。 2．免疫组织化学结果：不同浓度的大豆黄酮治疗组干预后3d后，Caspase-3蛋白在视网膜的内核层和外核层的表达低于阴性对照组，其中神经节细胞层的表达明显低于阴性对照组。 3．Western Blot结果：正常组的GAP-43蛋白表达量很少，不同浓度的大豆黄酮干预后，视网膜GAP-43蛋白的相对表达量与阴性对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。而三种浓度中100μmol/l治疗（D组）GAP-43蛋白的相对表达量最大，但三种浓度干预后GAP-43蛋白的相对表达量均不及mNGF治疗组。 第二部分 1．HE染色结果：对照组和治疗组的视网膜形态都出现视网膜各层组织结构逐渐模糊、变薄，神经节细胞数量减少，且病变随着时间延长进行性加重。对照组和治疗组的视网膜神经节细胞都随着时间的进行逐渐减少，但各时间点治疗组的RGCs数量均高于对照组，其中损伤后1d两组比较差异无统计学意义（P＞0.05），但在损伤3d、7d、14d以及28d四个时间点两组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。 2．免疫组织化学结果：大鼠视神经急性损伤后，随着时间的延长（1～28d），对照组和治疗组的视网膜Caspase-3蛋白表达都随之增加。但从不同的时间节点对比来看，各时间节点内大豆黄酮治疗组的总表达量相比要少于对照组。 3．Western Blot结果：治疗组和对照组视网膜GAP-43蛋白的相对表达量起初是随着时间点增加的，7d达到峰值，7d14d蛋白的表达量开始下降，到14d28d期间蛋白的表达量迅速下降。从治疗组和对照组对比来看，各时间点治疗组的蛋白表达量均高于对照组，在峰值7d时治疗组蛋白表达为治疗组的2倍多。 第三部分 1．免疫组织化学鉴定培养的细胞：原代培养72h后，对视网膜神经细胞进行荧光染色。大多数细胞呈NeuN阳性反应，具有神经元的特征。其中，NF-200阳性反应的细胞数约占NeuN阳性神经元的62%。 2．流式细胞仪定量检测：与正常组比较，随着大豆黄酮干预浓度（5μM、10μM、50μM、100μM）的增加，视网膜神经细胞的存活百分比逐渐增加，凋亡晚期细胞的百分比逐渐下降。浓度为100μM时，凋亡早期和凋亡总细胞的百分比明显下降。 3．RT-PCR检测基因GAP-43、Bcl-2和Bax的mRNA表达情况：四种浓度大豆黄酮培养神经细胞后3d，基因GAP-43、Bcl-2的mRNA表达水平都有不同程度的增高，其中5μM浓度时基因GAP-43的mRNA表达最高，10μM浓度时基因Bcl-2的mRNA表达最高。在大豆黄酮浓度为5μM、10μM、50μM时，基因Bax的mRNA的表达逐渐降低，但浓度为100μM时其表达升高超过了对照组。 结论： 玻璃体腔内注射大豆黄酮对大鼠视神经急性损伤具有神经保护效应，并且可能通过调控基因GAP-43、Bcl-2和Bax的mRNA水平发挥其抗凋亡和促进再生的作用。