玉米淀粉分支酶基因表达调控的研究

本项研究应用基因工程手段,克隆玉米淀粉分支酶基因的启动子和玉米淀粉分支酶基因,构建高效的反义表达载体和siRNA表达体系。通过农杆菌介导法和花粉管通道法将其导入玉米自交系,用以抑制淀粉分支酶基因的表达,调控淀粉的生物合成过程。以期通过基因工程手段,改变玉米淀粉合成途径,提高玉米直链淀粉的含量。取得如下结果: 1.以玉米品种“吉糯1号”的基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到玉米淀粉分支酶基因的启动子序列,克隆到pMD18-T Vector上,测序结果表明,该启动子大小为934bp。采用DNASIS软件进行启动子序列结构分析,发现该启动子含有种子特异表达所必需的元件,如TATA-box、CAAT-box、TACACAT序列、CATGCA序列、胚乳基序、GCN4基序和ACGT元件。与已报道的序列比较仅有14个核苷酸发生改变,同源性为98.5%。用该启动子取代植物表达载体pBI121的35S启动子,与gus基因编码区连接,构建成融合质粒pSBE-gus。经农杆菌介导法转化烟草,获得了转基因植株。GUS活性检测结果表明,由该启动子序列引导的gus基因能在种子中表达,而在其它组织中表达微弱或未表达,证实该启动子具有种子特异性表达的功能。 2.以普通玉米自交系铁7922为材料,取授粉10d的幼胚盾片向上接种于MB培养基上,诱导出的胚性愈伤组织多为颜色鲜艳、质地紧密、呈浅黄色的Ⅱ型愈伤组织。愈伤组织诱导率为82.5%,胚性愈伤组织诱导率为39.16%。培养2周后将其转入调控培养基,2,4-D的浓度为2mg/L,愈伤组织转变率为45.716%;确定的农杆菌转化体系为浸染时间为25min,菌液浓度为OD600为0.6,共培养时间为3d,其转化率达3.3%。 3.应用PCR技术扩增了玉米淀粉分支酶的基因片段,将其克隆到pMD18-Tvector载体上,测序结果表明。克隆片段大小为1698bp。采用DNASIS软件进行序列分析,与已发表的基因一致。将玉米淀粉分支酶基因片段反向插入到pCAMBIA1301 35S启动子下,构建成表达质粒pCJS2b。通过农杆菌介导法将其导入玉米自交系,以再生植株叶片的总DNA为模板,35S启动子和终止子中的一对序列为引物进行PCR扩增,结果从转化植株中扩增到1800bp的特异带,而未转化的植株中未扩增到该特异带。为进一步确定外源基因的整合情况,对PCR阳性植株进行Southern blot分析。结果表明,转化株株均有杂交带出现,外源基因以单拷贝和双拷贝的形式插入。而未经转化的植株没有杂交信号出现。证明外源基因已整合到基因组中。对转基因植株T1代的PCR分析结果表明,外源基因在转基因后代中能够遗传,其分离比符合孟德尔的遗传规律。以转基因玉米籽粒的总RNA为模板,与DIG标记的探针进行Northern杂交,发现转基因植株内源SBE mRNA