间歇性低压缺氧预处理诱导大鼠海马HO-1表达及其对缺血/再灌注脑组织的保护作用

目的:脑血管疾病严重危害人类健康,并且发病率一直居高不下。大部分的脑血管疾病为缺血性脑病,目前对于缺血性脑病的治疗主要为脑血管再通,恢复缺血脑组织的血液供应。但在此过程中会不可避免的产生脑缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion,I/R)。 目前,寻找减轻或预防脑缺血再灌注损伤的方法是研究者们工作的主要目标。1986年,Murry等人发现,给心脏一次或多次短暂缺血后,可诱导心脏抵抗较严重缺血引起的损伤,称之为缺血预处理,从此拉开了预处理研究的序幕。迄今为止,预处理的方法除了有缺血预处理,还有远端肢体缺血预处理以及缺氧预处理等方法。上世纪90年代,有研究报道,大鼠预先进行缺氧3 min处理,可对随后更严重的缺氧产生一定程度的耐受。近年来,人们开始研究缺氧预处理对缺血组织的保护作用,但是缺氧预处理的方法各异,目前尚缺乏公认理想的预处理模型,有关缺氧预处理对缺血组织保护作用的机制也不十分清楚。 本实验采用间歇性低压缺氧( Intermittent Hypobaric Hypoxia Preconditioning,IHHP)的方法对动物进行预处理,采用四血管阻断法复制大鼠全脑缺血模型,首先观察了IHHP对脑缺血再灌注大鼠海马神经元的保护作用,并进一步观察了IHHP对海马组织HO-1表达的影响及其HO-1对脑缺血再灌注组织的保护作用,探讨IHHP保护缺血再灌注海马组织的机制。 第一部分:IHHP对大鼠缺血/再灌注海马CA1区神经元的保护作用 方法:健康雄性Wistar大鼠30只,体重280～300g,随机分为5组,每组6只动物。分别为:①正常组(normal组):不做任何处理,直接断头取脑。②假手术组(sham组):只凝闭双侧椎动脉,48h后暴露双侧颈总动脉但不夹闭。③单纯间歇性低压缺氧预处理组(IHHP组):将大鼠暴露于低压(大气压为70.66-70.93kp)的缺氧环境,每日一次,共4次。④:缺血/再灌注组(I/R组):凝闭双侧椎动脉,48h后暴露双侧颈总动脉并夹闭8min,而后恢复血流再灌注。⑤间歇性低压缺氧预处理+全脑缺血/再灌注组(IHHP+I/R组):低压缺氧预处理4天,每天一次,第5天凝闭双侧椎动脉,48h后暴露双侧颈总动脉并夹闭8min,而后恢复再灌注。所有动物于再灌注后7天断头取脑,硫堇染色观察海马CA1区存活神经元密度值。 于高倍光学显微镜下计数海马CA1区每mm2内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目,每张切片双侧海马各计数3个区域,取平均值作为每一例的存活神经元密度值(neuronal density, ND)。 结果:Normal组大鼠海马CA1区锥体细胞排列整齐,包膜完整,胞核清晰,存活神经元密度值为142.67±13.30(cells/mm2,下同)。sham组大鼠海马CA1锥体细胞排列整齐,几乎无锥体细胞缺失现象,细胞膜完整,细胞核及核仁完整清晰,存活神经元密度值较高,为121.33±12.04,与normal组相比无显著差异(P>0.05)。IHHP组大鼠海马CA1区组织形态与normal组比较变化不明显,神经元密度为135.00±13.25,与normal组相比无显著性差异(P>0.05),但出现个别锥体细胞水肿及细胞间隙增宽的现象。I/R组大鼠海马CA1区组织明显损伤,胞膜完整、胞核清晰的锥体细胞稀疏,排列紊乱,锥体细胞明显缺失,存留细胞中部分细胞胞体形态不规则,呈多角型或梭型,胞膜皱缩,胞核固缩浓染,ND为39.30±9.90,与sham组相比,ND明显减少(P<0.01)。IHHP+I/R组海马CA1区锥体细胞排列情况和细胞形态均较I/R组明显改善,存活神经元密度值明显增加,(P<0.01),为89.33±13.50。以上结果表明,单纯IHHP并未引起海马神经元明显损伤,但可使海马神经元对其后发生的严重缺血产生一定程度的耐受。 第二部分:IHHP对大鼠海马CA1区HO-1表达的影响及其HO-1表达对缺血/再灌注脑组织的保护作用 方法:实验采用Wistar雄性大鼠90只,体重280～300g。实验分为两部分:第一部分观察IHHP对正常大鼠和缺血/再灌注大鼠海马HO-1蛋白表达的影响。第二部分观察HO-1蛋白表达对缺血再灌注脑组织的保护作用。 在观察IHHP对正常大鼠和缺血/再灌注大鼠海马HO-1蛋白表达影响的实验中(第一部分),将30只动物随机分为5组,分别为:①正常组(normal组),②假手术组(sham组),③单纯间歇性缺氧预处理组(IHHP组),④:缺血/再灌注组(I/R组),⑤间歇性低压缺氧预处理+全脑缺血/再灌注组(IHHP+I/R组)。各组动物处理同第一部分。于缺血再灌注24小时断头取脑,观察海马HO-1蛋白表达情况。 在第二部分实验中,将60只动物随机分为5组。每组12只动物。分别为:①间歇性低压缺氧预处理+全脑缺血/再灌注组(IHHP+I/R组):大鼠于双侧椎动脉凝闭术前4天,暴露于低压(大气压为70.66-70.93kp)缺氧环境,第5天行椎动脉凝闭, 48小时行颈总动脉夹闭,24小时后断头取脑。②间歇性低压缺氧预处理+全脑缺血/再灌注+溶剂组(IHHP+I/R+DMSO组):大鼠于双侧椎动脉凝闭术前4天,进行低压缺氧预处理,第5天行椎动脉凝闭,术前30分钟腹腔注射HO-1抑制剂Znpp的溶剂DMSO50μg,椎动脉凝闭后48小时行颈总动脉夹闭,24小时后断头取脑。③间歇性低压缺氧预处理+全脑缺血/再灌注+Znpp50μg组(IHHP+I/R+Znpp50μg组),④间歇性低压缺氧预处理+全脑缺血/再灌注+Znpp100μg组(IHHP+I/R+Znpp100μg组)和⑤间歇性低压缺氧预处理+全脑缺血/再灌注+Znpp150μg组(IHHP+I/R+Znpp150μg组),三组动物于凝闭椎动脉前30分钟分别腹腔注射HO-1抑制剂Znpp50μg、100μg和150μg,其他处理同IHHP+I/R+DMSO组。每组12只动物中,6只于缺血再灌注后24小时断头取脑,采用免疫组织化学方法观察海马HO-1蛋白表达;其余6只于再灌注7天断头取脑,用于硫堇染色,观察存活神经元密度值。 结果: 1 IHHP对大鼠海马CA1区HO-1表达的影响 Normal组大鼠海马CA1区HO-1阳性细胞稀少,阳性细胞染色较浅,阳性染色面积为146.96±10.94(μm2,下同),平均光密度值为0.05±0.03;与normal组比较,sham组大鼠海马CA1区HO-1免疫反应阳性染色面积和平均光密度值均无明显变化,阳性染色面积为211.02±17.00,平均光密度值为0.10±0.02。与normal组比较,IHHP组大鼠海马HO-1免疫反应阳性染色面积和阳性细胞平均光密度均有所增加,阳性染色面积为328.52±220.48,平均光密度为0.12±0.07(P<0.05)。与sham组比较,I/R组海马CA1区HO-1阳性细胞数目明显增多,阳性染色面积为660.50±63.12,平均光密度值明显增高,为0.25±0.17,二者与sham组相比均具有显著性差异(P<0.01)。IHHP+I/R组大鼠海马HO-1免疫反应染色面积和平均光密度值分别为1655.32±289.26和0.61±0. 49,与单纯I/R组相比,其阳性染色面积和平均光密度值均显著升高(P<0.01)。 2 HO-1表达对缺血再灌注脑组织的保护作用 2.1 Znpp对脑缺血再灌注大鼠海马CA1区HO-1蛋白表达的影响 IHHP+I/R组大鼠海马HO-1免疫反应阳性面积为1655.32±289.26,阳性细胞平均光密度值为0.61±0.49,IHHP+I/R+DMSO组大鼠海马HO-1免疫阳性面积为1667.00±121.77,平均光密度值为0.72±0.33,两组相比,阳性面积和阳性细胞平均光密度值均无显著差异(P>0.05)。IHHP+I/R+Znpp50μg组大鼠海马HO-1免疫反应阳性细胞面积为617.96±37.00,平均光密度为0.21±0.13,与IHHP+I/R组相比,二者均明显降低(P<0.05)。IHHP+I/R+Znpp100μg组HO-1免疫反应阳性面积和平均光密度值分别是204.99±121.51和0.07.±0.04,与IHHP+I/R+Znpp50μg组比较均有所降低(P<0.05);Znpp150μg组HO-1免疫反应阳性面积为161.11±68.25,平均光密度为0.06±0.03,与Znpp100μg组比较,二者均无统计学差异(P>0.05)。以上结果提示,腹腔注射Znpp可明显抑制IHHP和脑缺血再灌注诱导的海马HO-1蛋白表达。 2.2 Znpp对缺血再灌注海马CA1区神经元密度值的影响 IHHP+I/R组存活神经元密度值为89.33±13.50,IHHP+I/R+DMSO组大鼠海马存活神经元密度值为86.00±16.34,与IHHP+I/R组相比无显著性差异(P>0.05);IHHP+I/R+Znpp50μg组海马CA1区存活神经元密度值为63.33±9.26,与IHHP+I/R组相比有所降低(P<0.05)。Znpp100μg组海马CA1区可见大片神经元坏死,存活神经元显著减少,为39.33±9.93,与IHHP+I/R+Znpp50μg组比较进一步降低;IHHP+I/R+Znpp150μg组海马CA1区存活神经元密度值为40.00±9.79,与Znpp100μg组相比,无明显改变(P>0.05)。以上结果提示,Znpp抑制了海马HO-1表达,可使缺血再灌注海马组织存活神经元数目进一步减少,提示IHHP和缺血再灌注诱导的HO-1表达对海马神经元具有保护作用。 结论: 1单纯间歇性低压缺氧预处理对大鼠海马神经元无明显损伤,但可减轻大鼠全脑缺血/再灌注引起的海马CA1区神经元损伤程度,对全脑缺血/再灌注后大鼠海马组织具有保护作用。 2间歇性低压缺氧预处理可上调缺血/再灌注海马组织HO-1蛋白的表达。 3 HO-1对于缺血再灌注脑组织具有保护作用,这可能是间歇性低压缺氧预处理保护大鼠缺血/再灌注脑组织的重要机制之一。