丝素蛋白材料体外生物相容性的研究

丝素蛋白是一种来自于家蚕的天然蛋白,可被加工成一系列具有可控的机械性能和降解速率的材料,在包括药物缓释、组织工程及植入装置等很多生物领域应用具有广阔的前景。本文研究不同丝素蛋白材料的体外生物相容性。通过添加聚乙二醇(400 Da)和甘油于丝素蛋白溶液中,混合液在4℃和37℃自然风干成膜,获得了不同表面形貌、不同二级结构和不同机械性能的丝素蛋白复合膜。同样条件下制备的纯丝素膜作为对照。在4℃风干的复合膜和纯丝素蛋白膜以Silk I(ɑ-螺旋)结构为主,而37℃风干的复合膜以Silk II(?-折叠)结构为主。4℃风干的复合膜在干态时应变达到175.31±16.10%,37℃风干的复合膜则为106.21±25.27%,分别是纯丝素对照样的43和26倍。HS.SK.865成纤维细胞和单核细胞THP-1来源的巨噬细胞种植于不同丝素蛋白膜上,通过测定细胞增殖,观察细胞形态及定量检测细胞炎性基因CCR7,IL-6,TNF-α和IL-1β的表达,评定丝素蛋白膜的生物相容性。成纤维细胞在4℃风干的复合膜培养5天后的细胞增殖速率是纯丝素膜上的6.1倍,而巨噬细胞在37℃风干的复合膜上培养24 hrs后,炎性基因CCR7的表达是纯丝素膜上的13.4%。因此,不同性能的丝素蛋白膜对细胞增殖和炎症基因表达均有不同程度的影响。此外,添加聚乙二醇(10 KDa)溶液至不同浓度的丝素蛋白溶液中,混合液再滴加至无水乙醇中,获得平均粒径为54.77±12.89μm,5.44±1.16μm,374.47±4.75 nm的三种不同大小的丝素蛋白颗粒(L-SMSs,S-SMSs,SNPs),进而与HS.SK.865成纤维细胞和THP-1来源的巨噬细胞共培养。经检测证明在中低剂量时,较大的丝素蛋白微球L-SMSs和丝素蛋白纳米颗粒SNPs均未显著影响细胞增殖,而S-SMSs则明显抑制增殖。与巨噬细胞共培养24 hrs后,中浓度S-SMSs组巨噬细胞炎性基因CCR7的表达是L-SMSs组的1.9倍,是空白板的1.7倍。而低浓度SNPs炎性基因IL-6的表达则是高浓度(50μg/mL)的61.0倍,是空白板的51.2倍。同时中浓度SNPs炎性基因IL-1β的表达则分别是高浓度(50μg/mL)的2.1倍,是空白板的1.8倍,高浓度SNPs组的超低IL-6、IL-1β表达有可能是由于纳米颗粒引起的细胞凋亡导致的。随后的激光共聚焦显微镜实验证明,巨噬细胞几乎不会吞噬L-SMSs,而大量吸附吞噬S-SMSs和丝素蛋白纳米颗粒SNPs。这结果与细胞总活力、基因表达基本一致。综上所述,以体外培养成纤维细胞和巨噬细胞为模型,可以对具有不同形态和性质的丝素蛋白材料进行生物相容性和安全性评价,所建立的方法可以为将来一系列的生物材料的设计和开发提供参考依据。