基于慢性不可预知温和应激大鼠模型的“肝主疏泄”生物学基础研究

目的从解剖肝与功能肝两个角度,在器官、蛋白、基因三个层面,对“肝主疏泄”的生物学基础进行初步探索。方法实验研究分三部分：(一)对慢性应激进行8周的动态观察。采用体重、糖水偏好实验、旷场实验、小动物肝脏超声、脑静息态BOLD方法(Reho和ALFF),对慢性不可预知温和应激大鼠模型的抑郁状态、肝脏解剖形态及血流动力学、全脑神经元异常活动脑区进行动态检测分析,从动态角度观察“肝失疏泄”过程解剖学肝脏及中枢脑区的变化,阐释“肝主疏泄”的生物学内涵。(二)在实验一的基础上,筛选慢性应激抑郁症肝郁脾虚证大鼠模型,采用肝脏超声、脑静息态BOLD(Reho和ALFF)、酶联免疫法、高效液柑、数字化基因表达谱、PCR等方法,根据973课题假说,进行相关肝血流动力学、神经元活动异常脑区、血液相关理化指标(Hcy、Ang-Ⅱ、5-HT、NE、DA、Cort),下丘脑神经递质(NE、DOPAC、DA、5-HIAA、5-HT、HVA)、肝、海马差异基因的检测及分析,从“疏泄不及”的病理模型角度阐释“肝主疏泄”的生物学内涵。(三)观察四逆散对抑郁症肝郁脾虚证模型的抗抑郁分子机制,采用与实验二相同的方法对相关血液理化指标(Hcy、Ang-Ⅱ、5-HT、NE、DA、Cort)、下丘脑神经递质(NE、DOPAC、DA、 5-HIAA、5-HT、HVA)、部分肝脏差异基因(Cyp1a1、Cyp1a2、Cyp7b1、Hnf4a、和Hnf4γ)指标进行检测,并对分子生物学结果与行为学实验进行相关分析,从疏肝效应角度,对“肝主疏泄”的分子生物学基础进行阐释。结果(一)从慢性应激第2周起,CUMS组大鼠的体重、糖水偏好度以及自主活动度均显著低于正常组，应激8周时,CUMS组大鼠肝静脉管径显著高于正常组,在应激2周、4周、6周时,肝静脉血流流速显著低于正常组,肝静脉血流流量在第6周显著低于正常组。门静脉血流流速在应激4、8周时显著低于正常组,门静脉血流流量在应激第8周时显著低于正常组；应激第2周时,模型组与正常组相比小脑后叶Reho增强,应激4周时,海马、嗅皮层、感觉皮层、纹状体Reho增强,应激6周时,海马、背侧丘脑外侧核群Reho减弱,应激8周时,海马、下丘脑乳头区、中脑被盖部、嗅皮层、梨状皮层、脑桥基底部Reho均减弱。在应激第2周时,模型组与正常组相比主要表现为嗅球ALFF增强,岛叶皮层、嗅皮层、感觉皮层减弱,应激4周时，呈现海马、视觉皮层ALFF增强状态；应激6周时,运动皮层、感觉皮层ALFF增强,背侧丘脑外侧核群、延髓、中脑被盖部、脑桥基底部、脑桥被盖部ALFF减弱,应激8周时,小脑核、下丘脑视前区、脑桥基底部ALFF减弱。(二)抑郁症肝郁脾虚组大鼠的体重与糖水偏好度、穿格总距离与直立次数较正常组均明显降低；门静脉血流流速、流量均较正常组显著降低；静息态BOLD结果同实验一第8周结果；抑郁症肝郁脾虚证大鼠下丘脑5-HT、5-HIAA、DA含量较正常组显著降低；抑郁症肝郁脾虚大鼠血液Hcy含量显著高于正常组,Cor含量显著增加,NE含量显著降低；与正常组相比,肝郁脾虚组模型大鼠肝脏共有46个差异表达基因,海马共有85个差异表达基因,两者KEGG富集通路中最显著的6条通路中均涉及到细胞色素P450家族基因,分别采用PCR对其进行验证,结果呈一致性。(三)四逆散可显著改善抑郁症肝郁脾虚模型大鼠的直立次数,在穿格总距离、糖水偏好度及游泳不动时间仅表现改善趋势；血液理化指标中四逆散与模型组相比,Ang-Ⅱ显著降低,其它无明显差异；四逆散组可显著改善下丘脑5-HT水平,对下丘脑5-HIAA、DA水平有改善趋势；直立次数与下丘脑5-HIAA、5-HT、DA、肝脏Hnf4y基因表达量呈显著正相关,穿格总距离、游泳不动时间分别与5-HIAA呈显著正相关与负相关。结论(一)器官层面：动态观察及病理模型两个角度证明肝疏泄功能涉及肝血流动力学尤其是肝脏门静脉血流动力学的改变,脑边缘系统尤其是海马、下丘脑等以及一些非边缘脑区包括小脑、中脑、感觉皮层、视皮层、运动皮层等均存在神经元活异常改变；蛋白层面：病理模型及疏肝方剂反证两个角度共同证明血液Cort、下丘脑5-HT及DA是“肝主疏泄”生物学基础之一；基因层面：“肝失疏泄”时解剖学肝脏、功能学肝脏(海马)均存在CYP450家族的代谢功能障碍。(二)四逆散可通过调节下丘脑神经递质及肝脏Hnf4α、Hnf4γ基因水平发挥抗抑郁效应,为现代医学中抑郁症的发病机制与肝脏之间的联系做出一些提示。(三)动态观察、抑郁症肝郁脾虚证模型以及疏肝方剂疗效三个角度共同证明解剖学肝脏与功能性肝脏均为中医肝藏象理论的组成部分。