黄芪甲苷抗甲型流感病毒作用研究

流感是由流感病毒引起的急性呼吸道疾病,具有感染宿主广泛,传播迅速,致病率高等特点。甲型流感病毒容易引发流感大流行,其死亡率高于季节性流感,对人类和动物的生命健康造成了严重的威胁。疫苗是预防流感的主要策略,但流感病毒的高度变异,疫苗研发的滞后性以及对不同流感毒株不能产生交叉保护作用等缺陷限制了疫苗的有效使用。目前,临床上可用的抗流感病毒药物包括M2离子通道抑制剂(金刚烷胺和金刚乙胺)和神经氨酸酶抑制剂(扎那米韦、奥司他韦和帕拉米韦)。M2离子通道抑制剂因多年使用已造成临床流行毒株对其100%耐药,神经氨酸酶抑制剂的耐药毒株也在日益增加。疫苗与化药的缺陷使得流感的防治举步维艰。因此,迫切需要开发新型高效广谱抗流感病毒药物来应对流感疫情。黄芪甲苷(AstragalosideIV,AST)为羊毛酯醇型的四环三萜皂苷,是名贵中药材黄芪的主要活性成分。大量研究表明,AST具有免疫调节、器官保护、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、改善血液流变性等药理作用。但有关AST抗流感病毒的研究还未见报道。本文分别以A/PR/8/34(H1N1,PR8),A/Guangzhou/03/2009(panH1N1和A/Duck/Guangdong/99(H5N1)三种不同流感病毒株感染人肺癌上皮细胞(A549),建立体外流感病毒感染模型,以终点稀释法测定病毒滴度,评价了AST的体外抗流感病毒活性。通过建立流感病毒BALB/c小鼠感染模型,以小鼠存活率、体重变化等为指标,评价了AST的体内抗流感病毒活性。此外,本文基于PR8毒株细胞感染模型设计了一系列实验,初步探索了AST抗流感病毒活性的作用机制。在不同时间点加药实验中,通过荧光定量PCR方法检测了AST对流感病毒NP mRNA在A549细胞中的表达的影响,以此判断病毒复制的哪一阶段受到AST抑制;通过血凝抑制、溶血抑制及神经氨酸酶活性抑制试验研究了AST对流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的影响,以初步阐述黄芪甲苷的抗流感病毒作用机制。结果表明,AST在6.25～25μg/mL的浓度范围对PR8、panH1N1和H5N1毒株在A549细胞中的增殖有显著的抑制活性,且不易诱导病毒株的耐药变异;在400μg/m L及其以下浓度AST对A549细胞没有毒性。30 mg/kg/d的AST皮下注射给药对感染PR8小鼠具有显著的生命保护作用,具体表现为显著提高了感染小鼠的存活率及其平均存活时间,抑制了感染小鼠的体重下降。不同时间点加药试验结果表明,AST在病毒感染细胞后0～2 h内给药显著抑制流感病毒复制。然而,血凝抑制和溶血抑制试验结果表明AST对流感病毒的吸附和膜融合没有抑制活性。NA活性抑制试验结果表明AST对流感病毒的NA无抑制活性。综合以上机制研究结果,我们推测AST通过抑制流感病毒的早期复制而发挥抗病毒活性。本文首次发现黄芪甲苷具有显著体内外抗流感病毒活性,且不易诱导病毒产生耐药变异。本论文结果为阐明黄芪及其复方制剂临床上防治流感的药效物质基础及黄芪甲苷作为新型抗流感病毒药物或先导化合物的研究开发提供了初步依据。